暢通，劉飛

(上海海利生物技術股份有限公司，上海獸用生物制品工程技術研究中心，上海 201403)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)為圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的成員。無囊膜，不具有血凝活性，是目前人類發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒[1]。PCV主要有兩種血清型，即PCV1和PCV2。PCV1對豬的致病性較低，尚沒有試驗證明其具有感染性;PCV2對豬的危害性極大，可引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)和母豬繁殖障礙等[2-3]。

自2010年開始一種有圓環(huán)病毒特征的新型病毒被陸續(xù)報道，但未確定其種屬。直到2016年才將該病原體命名為豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)[4-5]。同年3月，在我國遼寧、江西、重慶3個地區(qū)豬場共計356頭母豬，先后發(fā)生繁殖障礙導致新生仔豬死胎率達到5.02%～20.1%，母豬死亡率達到5.4%～10.5%，利用RT-qPCR或qPCR對相關病原進行檢測后，發(fā)現(xiàn)只有PCV3顯示陽性[6]。2017年初，首次檢出并公布PCV3在我國流行[6]。目前國內豬圓環(huán)病毒3型分為2個簇，即3a和3b。美國PCV3分離株PCV3-USA-MO2015(KX778720.1)屬于3a簇群。為了檢測PCV3 流行情況，國家獸用藥品工程技術研究中心收集福建、河北、河南等8個省份發(fā)病豬場189份臨床樣品，陽性率達到12.7%；同時，該中心利用PCV3 ELISA抗體檢測方法檢測了江西、安徽、河南等14個省份908份血清樣品，陽性率高達 48.02%[4-6]。由此可見，PCV3早已廣泛流行于我國豬群中。

實時熒光定量PCR(qPCR)技術具有精確度高、特異性強、重復性好、自動化程度高的優(yōu)點[7-8]，目前已廣泛應用于各種動物病原的快速檢測。本試驗擬建立PCV3的熒光定量PCR檢測手段，以期為疫苗研發(fā)、生產檢驗及流行病學檢測等提供一種快捷可靠的技術。

1 材料與方法

1.1 病料及陽性質粒來源

PCV3陽性豬血清采自湖北某豬場；PCV2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬細小病毒(PPV)、偽狂犬病毒(PRV)及豬瘟病毒(CSFV)陽性質粒均由本實驗室鑒定并保存。

1.2 主要試劑及儀器

病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒和質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)和pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司，steponeplus 實時熒光定量PCR儀和普通PCR儀為美國ABI公司產品。

1.3 引物的設計與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)布的PCV3的Cap基因的核苷酸序列(序列號：AYA44222.1)，通過MegAlign軟件比對序列，選擇一段相對保守序列的區(qū)域，利用Primer Premier 5.0軟件進行分析，設計特異性qPCR引物和探針。上游引物序列為PCV3-Fq：GAGGCTTTGTCCTGGGTGAG，下游引物序列為PCV3-Rq:ATGCGGAAAGTTCCACTCGT，熒光探針序列為PCV3-CAP-Pq：CCGTTACTTCACCCCCAAACCAATTCT，預計擴增的目的片段長度為113 bp。引物探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 質粒標準品DNA模板的制備

按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒的操作說明書，提取PCV3陽性毒株的DNA，并以此DNA為模板，使用上述熒光定量PCR引物進行PCR擴增。50 μL擴增體系為：Premix Taq預混酶25 μL，上、下游引物各2 μL，模板2 μL，ddH2O 19 μL。反應程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。采用1%濃度的瓊脂凝膠電泳對PCR產物進行驗證。

使用瓊脂凝膠回收試劑盒對初步驗證正確的PCR產物進行切膠、回收、純化，然后與載體pMD18-T連接，轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，氨芐平板上挑取單菌落，過夜搖菌后提取重組質粒標準品。使用NANODROP 2000核酸蛋白儀對質粒質量濃度進行測定，結果為395 ng/ μL。將質粒標準品進行qPCR驗證，同時送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.5 TaqMan熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化

為獲得較為理想的Ct值，提高反應靈敏性，分別對退火溫度、熒光探針與模板添加量的比例進行優(yōu)化試驗，篩選出Ct值最小時對應的最優(yōu)退火溫度、熒光探針與模板添加量的比例。退火溫度分別為50 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃，熒光探針與模板的比例分別為1∶1、1∶2、2∶1。每次試驗均設立對照(no template control，NTC)。

1.6 標準曲線的建立及敏感性試驗

采用1.5確定的最佳qPCR反應條件和反應體系，使用滅菌ddH2O將質粒標準品經10倍梯度稀釋(10-1～10-8)后作為模板進行實時熒光定量PCR擴增反應，反應完畢由系統(tǒng)自動繪制生成標準曲線。

1.7 特異性試驗

以PCV3、PCV2、PRRSV、PEDV、PPV、PRV、CSFV陽性質粒為模板，通過建立的熒光定量PCR體系進行qPCR反應，同時設立NTC對照，以此來評價該方法的特異性。

1.8 重復性試驗

1.9 臨床樣本的檢測

取本實驗室保存的湖北某豬場的72份豬血清，使用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取病毒基因組，采用上述已建立好的TaqMan熒光定量PCR方法和普通PCR方法進行檢測。

2 結果

2.1 標準品質粒構建

提取PCV3的DNA經設計的特異性引物PCR擴增后獲得預期大小的片段。然后回收目的片段、連接、轉化，挑取典型單菌落搖菌后提取重組質粒標準品。通過PCR、酶切及測序鑒定，構建的重組質粒標準品正確。PCR擴增出現(xiàn)645 bp的目標條帶，陰性對照無特異性條帶出現(xiàn)(見圖1)。

M.DNA分子質量標準；1.增的PCV3目的片段；2.陰性對照圖1 PCR 擴增

2.2 TaqMan熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化

經過一系列熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化(見表1)，得到最優(yōu)反應體系為：Premix Ex Taq(2×)10 μL，ROX Reference Dye(50×)0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，熒光探針0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL。最優(yōu)反應程序為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，54 ℃ 1 min,40個循環(huán)。

表1 熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化結果

2.3 熒光定量 PCR 標準曲線的繪制

將質粒標準品做10倍梯度稀釋后作為模板，采用上述優(yōu)化的qPCR體系和程序進行PCR反應，得到不同濃度模板的擴增曲線(見圖2)。以起始模板濃度的對數(shù)為橫坐標，熒光Ct值為縱坐標繪制標準曲線(見圖3)。如圖3所示，樣品初始模板的濃度(x)與Ct值(y)的線性關系式為：y=-3.266x+37.41，斜率為-3.266，截距為34.939，相關系數(shù)R2為1，擴增效率為102.371%。

圖2 以不同濃度的標準質粒為模板制作的擴增曲線

圖3 實時熒光定量PCR標準曲線

2.4 特異性試驗

采用已建立好qPCR方法對PCV3、PCV2、PRRSV、PEDV、PPV、PRV、CSFV陽性質粒進行檢測，結果顯示，只有PCV3陽性質粒的檢測結果為陽性，其他均為陰性(見圖4)。將PCV3 qPCR擴增產物進行瓊脂凝膠電泳檢測，僅在113 bp處擴增出1條特異性條帶，結果與預期大小相符(見圖5)。

A.PCV3陽性質粒；B～G.分別為PCV2、PRRSV、PEDV、PPV、PRV、CSFV的陽性質粒。圖4 實時熒光定量PCR特異性的檢測

M. DNA 分子質量標準；1.熒光特異性引物的擴增產物；2.陰性對照圖5 熒光特異性引物的PCR檢測

2.5 靈敏性試驗

將PCV3 qPCR擴增產物進行瓊脂凝膠電泳檢測，僅在113 bp處擴增出一條特異性條帶，結果與預期相符(見圖5)。

將PCV3陽性樣品10倍梯度稀釋作為模板，同時采用上述已建好的qPCR方法和常規(guī)PCR方法對稀釋好的模板進行靈敏性對比檢測。結果顯示，熒光定量PCR方法可檢測到10-7對應的陽性模板(見圖6)，而常規(guī)PCR方法只能檢測到10-5對應的陽性模板(見圖7)。

1～8.分別為10-1～10-9稀釋的標準質粒； NTC.陰性對照圖6 實時熒光定量PCR靈敏性試驗結果

M. DNA 分子質量標準；1～8.分別為10-1～10-8稀釋的標準質粒；9.陰性對照圖7 常規(guī)PCR靈敏性試驗結果

2.6 重復性試驗

采用本研究建立的熒光定量PCR方法，分別作批內重復試驗和批間重復試驗，通過統(tǒng)計學方法計算變異系數(shù)，結果見圖8、表2和表3。

圖8 批內重復性試驗

表2 實時熒光定量 PCR 的批內重復性試驗

表3 實時熒光定量 PCR 的批間重復性試驗

重復性試驗顯示，批內變異系數(shù)為0.01%～0.41%，批間變異系數(shù)為0.02%～0.47%，變異系數(shù)均小于2%，說明離散程度較小，本方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性。

2.7 臨床樣本的檢測

應用本試驗建立的PCV3熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法對采自湖北某豬場的72份血清樣品進行檢測。結果顯示，該熒光定量PCR方法陽性檢出率為16.7%，而常規(guī)PCR陽性檢出率為12.4%，將常規(guī)PCR檢測的陽性品經熒光定量PCR復檢全部為陽性。說明該熒光定量PCR方法更為靈敏，可用于大批量樣本的快速定量檢測。

3 討論

自2016年末PCV3被正式命名以來，雖然報道的文獻很少，但是其檢測陽性率居高不下，充分顯示PCV3正在全國豬場中大規(guī)模流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經濟損失。研究和建立一種快速有效檢測方法對于有效防控PCV3的傳播，提高我國豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重大意義。

目前圓環(huán)病毒的主要診斷方法有病毒分離鑒定、電鏡檢查、原位雜交、免疫組化和PCR等[9-11]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，熒光定量PCR已被廣泛用于病原快速定量檢測和基因分型等方面[12-13]。該方法全程在單管封閉環(huán)境下進行，微機控制，避免了假陽性或者假陰性的出現(xiàn)，具有極高的靈敏性，非常適合微量病原的快速檢測[14]。

本研究以PCV3的ORF2基因保守區(qū)域設計特異性熒光引物和探針，建立了TaqMan熒光定量PCR檢測方法。進一步優(yōu)化反應程序和反應體系，提高了反應的特異性和靈敏性。通過構建質粒標準品，繪制標準曲線，可見在3.39×101～3.39×107copies/μL范圍內，Ct值與模板拷貝數(shù)對數(shù)之間呈良好的線性關系，線性方程的相關系數(shù)R2達到1；特異性試驗結果表明，PCV3與PCV2、PRRSV、PEDV、PPV、PRV、CSFV均無交叉反應，具有良好的特異性；該qPCR方法的靈敏度達到10 copies/μL，比常規(guī)PCR靈敏100倍；通過對72份臨床樣本進行檢測，建立的qPCR方法陽性檢出率為16.7%，而常規(guī)PCR陽性檢出率為12.4%，說明該qPCR方法具有較高的靈敏性；重復試驗結果表明，批間和批內試驗變異系數(shù)均小于2%，說明該方法具有良好的重復性。

綜上，本研究建立的TaqMan熒光定量PCR具有特異性強、靈敏度高、重復性好的優(yōu)點。在實際生產中，可為PCV3早期流行的分子生物學診斷、病原定量檢測提供一種快速有效的技術方法。