季剛，俞天奇，張宜娜，周繼勇，胡伯里*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 浙江大學(xué)動物醫(yī)學(xué)系/農(nóng)業(yè)部動物病毒學(xué)重點實驗室，浙江 杭州 310058)

傳染性法氏囊病(infectious bursal disease， IBD)是一種具有高度傳染性，免疫抑制性的疾病，病原體主要通過損害雞的免疫器官法氏囊從而引起雞的發(fā)病死亡。傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的基因組由兩個片段A和B組成，A片段編碼4個蛋白，分別是衣殼蛋白VP2、支架蛋白VP3、具有水解酶活性的蛋白VP4以及非結(jié)構(gòu)蛋白VP5[1-4]；B片段只編碼VP1蛋白，該蛋白具有RNA聚合酶的功能。VP5蛋白與病毒毒力的強弱密切相關(guān)，研究其功能有助于更好地了解病毒復(fù)制全過程。RNA干擾技術(shù)可阻斷靶基因的表達進而阻斷蛋白的表達，利用其研究蛋白功能，獲得能使目的基因降解的dsRNA是實施RNA干擾技術(shù)的前提。

目前，在研究基因功能的過程中，相應(yīng)基因的dsRNA主要是通過商業(yè)化的試劑盒合成。雖然該方法能獲得基因dsRNA，但合成過程中所需的經(jīng)濟成本以及大量時間的耗費限制了dsRNA的大批量生產(chǎn)，制約了對其功能的研究。而在異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-B-thiogalactoside，IPTG)的誘導(dǎo)下，利用大腸桿菌HT115(DE3)可以大量合成dsRNA,且可以顯著降低成本[5]。本文通過構(gòu)建帶有目的基因VP5的RNA干擾載體，利用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌HT115(DE3)表達并合成IBDV-VP5-dsRNA，為進一步研究VP5基因功能打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 RNA干擾載體

L4440質(zhì)粒，由中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所楊璞老師贈送；反向遺傳質(zhì)粒pcdna 3.0-A，由本實驗室保存。

1.2 菌株

大腸桿菌HT115(DE3)型菌株，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系和農(nóng)業(yè)部有害生物監(jiān)測與綠色防控重點實驗室沈杰老師饋贈。

1.3 主要試劑

AceQ qPCR Probe Master Mix、Hiscript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、2×taq plus master mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)，四環(huán)素(Tet)、溶菌酶(上海生工生物工程有限公司)，質(zhì)粒提取試劑盒(TIANGEN公司)，DNA純化回收試劑盒、PCR清潔回收試劑盒(AXYGEN公司)，核酸Marker (TaKaRa公司)，Trizol(上海普飛公司)等。

1.4 dsRNA合成引物的設(shè)計

目的基因的上游引物的5′端和下游引物3′端分別加上NheⅠ、XbaⅠ酶切位點。

1.5 重組載體L4440-IBDV-VP5的構(gòu)建

1.5.1 目的片段的克隆與回收

使用phanta Max Super-Fidelity DNA酶，以pcdna3.0-A載體為模板，用表1中的有關(guān)引物進行PCR反應(yīng),延伸時間設(shè)置為30 s，35個循環(huán)反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在紫外燈下切取凝膠，參考DNA凝膠回收試劑盒方法回收DNA片段，測完濃度后并將回收產(chǎn)物置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 dsRNA合成引物和重組質(zhì)粒鑒定引物

1.5.2 膠回收產(chǎn)物與L4440載體酶切、連接、轉(zhuǎn)化

利用NheⅠ、XbaⅠ37 ℃過夜酶切質(zhì)粒與膠回收片段，使用T4連接酶進行連接反應(yīng)，按照相應(yīng)的比例在16 ℃下連接4 h。從-80 ℃冰箱中取HT115(DE3)感受態(tài)細胞并迅速放入冰上，待感受態(tài)細胞融化后，吸取10 μL連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中，用移液器輕輕吹打使其混勻，并將其放置冰上冰浴30 min。隨后，將其再放入42 ℃水浴鍋中熱激90 s，熱激后迅速置于冰上2～3 min。加入無抗的LB液體培養(yǎng)基，混勻后放入37 ℃搖床培養(yǎng)2 h，低速離心，棄掉部分上清。將菌體重懸后涂布于含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的LB平板上，將平板倒置放于于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h。

1.5.3 陽性克隆的篩選

待平板上長出細菌后，挑取7個單菌落放于裝有1 mL的含有四環(huán)素抗性的LB培養(yǎng)基中，并放入搖床培養(yǎng)2 h，分別利用表格1中的上下游引物test-F、test-R菌液PCR鑒定。菌液PCR程序參考1.5.1中的反應(yīng)程序。反應(yīng)結(jié)束后在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，通過觀察條帶大小，500 bp左右即為正確條帶。在超凈工作臺中吸取部分菌液送與公司測序，剩余菌液保存于4 ℃?zhèn)溆?。待測序正確后，擴大培養(yǎng)菌液并參照質(zhì)粒小提中量試劑盒(TIANGEN)說明書進行質(zhì)粒提取。

1.6 IBDV-VP5-dsRNA的誘導(dǎo)表達

取過夜培養(yǎng)的菌液，將其按照1∶500比例接種于100 mL的含有氨芐和四環(huán)素抗性的LB液體培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)基放入37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h左右，至菌液呈現(xiàn)云霧狀即細菌達到對數(shù)生長期時，吸取1 mL菌液放入EP管中作為誘導(dǎo)前菌液備用，在剩余培養(yǎng)基中加入經(jīng)過無菌處理的終濃度約為0.4 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)放入37 ℃振蕩培養(yǎng)4～5 h。收集菌液并以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，收集菌體，將收集到的菌體用濃度為500 mg/mL的溶菌酶常溫裂解10～20 min，并用Trizol法提取dsRNA，dsRNA用高壓過后的DEPC處理水溶解，并從溶解液中取出少量測定其濃度。最后，用降解DNA(DNaseI)和降解單鏈RNA(RNaseA)消化處理1 h，以獲得較純的dsRNA，并進行電泳檢測。

1.7 dsRNA原核表達條件的優(yōu)化

分別于對數(shù)生長期添加不同量的IPTG，使其終濃度分別為0.2 mmol/L、0.4 mmol/L和0.6 mmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)4 h，取樣提取dsRNA。分別于對數(shù)生長期放入16 ℃、37 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)4 h，取樣提取dsRNA。分別于對數(shù)生長期，誘導(dǎo)0、1、2、3、4、5、6、7 h，提取dsRNA。通過RT-qPCR檢測dsRNA相對表達量，確定最佳表達條件。以U16S為作標準化的內(nèi)源對照。U16S引物的序列為：U16S正向，5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′和U16S反向，5′-TATTACCGCGGCTGCTGGC-3′。dsRNA引物序列為：IBDV-VP5正向，5′-GTCAGTAGAGATCA-3′和IBDV-VP5反向，5′-ATGACAAACCTGCAAGATCA-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆

以本實驗室保存的含有傳染性法氏囊病毒A片段全長的反向遺傳質(zhì)粒pcdna 3.0-A為模板，進行目的片段的擴增，獲得500 bp左右片段，如圖1所示。

M.Marker；1.帶有酶切位點的VP5片段圖1 目的基因的克隆

2.2 重組載體L4440-IBDV-VP5的鑒定

隨機挑取7個單菌落進行菌液PCR鑒定，陽性克隆產(chǎn)物應(yīng)為500 bp左右(圖2)，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果與預(yù)期片段大小基本相符，菌液測序結(jié)果也正確。

M.Marker；1～7.克隆載體菌液PCR鑒定；8.陰性對照圖2 重組載體L4440-IBDV-VP5菌液PCR鑒定

2.3 原核誘導(dǎo)HT115(DE3)表達IBDV-VP5-dsRNA

將在IPTG誘導(dǎo)前后收集的菌液低速離心，得到的菌體用溶菌酶處理后，用Trizol法提取細菌總RNA。將提取產(chǎn)物經(jīng)DNaseI(單鏈或雙鏈DNA)和RNaseA(單鏈RNA)消化處理后分別通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。已知目的基因VP5的長度約為500 bp，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液能夠表達出相應(yīng)大小的dsRNA，且未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液未能表達出dsRNA，結(jié)果如圖3所示。

M.Marker；1.IPTG誘導(dǎo)前提取的dsRNA；2.IPTG誘導(dǎo)后提取的dsRNA；3. 經(jīng)DNaseI、RNaseA處理后的dsRNA圖3 dsRNA的誘導(dǎo)表達

2.4 dsRNA原核表達條件的優(yōu)化

2.4.1 不同IPTG濃度對dsRNA誘導(dǎo)表達產(chǎn)量的影響

分別于對數(shù)生長期(OD600=0.6)添加不同量的IPTG，使其終濃度分別為0.2、0.4和0.6 mmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)4 h，隨后提取dsRNA并通過RT-PCR檢測dsRNA相對表達量。由圖4可以看出，不同濃度的IPTG對于dsRNA 表達量有不同的作用，dsRNA的表達量隨著IPTG濃度的增高而增高。當IPTG終濃度為0.6 mmol/L的左右，dsRNA的表達量相對較高，但差異不顯著(P>0.05)。

圖4 不同IPTG濃度對dsRNA誘導(dǎo)表達產(chǎn)量的影響

2.4.2 不同誘導(dǎo)時間對dsRNA表達量的影響

分別于對數(shù)生長期(OD600=0.6)添加終濃度為0.6 mmol/L的IPTG，在37 ℃分別誘導(dǎo)0、1、2、3、4、5、6、7 h后，提取dsRNA并通過RT-PCR檢測dsRNA相對表達量，得到不同誘導(dǎo)時間與dsRNA誘導(dǎo)表達產(chǎn)量的關(guān)系。由圖5可以看出，誘導(dǎo)時間對于dsRNA表達量是有影響的，隨著誘導(dǎo)時間的延長，dsRNA的表達量先增大后減少。當誘導(dǎo)時間為5 h時，dsRNA的表達量相對較高。

圖5 不同誘導(dǎo)時間對dsRNA表達量的影響

2.4.3 不同誘導(dǎo)溫度對dsRNA表達量的影響

分別于對數(shù)生長期(OD600=0.6)添加同量的IPTG，使其終濃度為0.6 mmol/L，分別在16 ℃和37 ℃誘導(dǎo)5 h后，提取dsRNA并通過RT-PCR檢測dsRNA相對表達量，得到不同誘導(dǎo)溫度對dsRNA誘導(dǎo)表達產(chǎn)量的關(guān)系。不同誘導(dǎo)溫度對于dsRNA表達量是有影響的，在相同IPTG 濃度下，當誘導(dǎo)溫度為37 ℃時，dsRNA的表達量相對較高。

綜上，針對該菌株，當IPTG誘導(dǎo)終濃度為0.6 mmol/L，在37 ℃誘導(dǎo)5 h，dsRNA相對表達量最高。

3 討論

RNA干擾技術(shù)可以高效沉默同源mRNA[6-8]，進而阻斷靶基因的表達[9-10]，是研究基因功能的有效方法[11-13]，而dsRNA的獲取是進行該研究的前提。目前，通過商業(yè)化試劑盒合成dsRNA的成本太高且操作復(fù)雜，原核表達相應(yīng)基因dsRNA方法的建立，為dsRNA的獲取提供了便利，其僅需少量菌液即可獲取大量目的基因的dsRNA。在利用基因工程菌原核表達dsRNA的方法中，IPTG的使用會使成本增加，探索IPTG最適誘導(dǎo)濃度是減少成本的重要途徑之一。通過對IPTG的濃度的摸索確認最佳的IPTG的使用濃度，同時通過對誘導(dǎo)時間以及誘導(dǎo)溫度的探究確定了最佳的誘導(dǎo)時間與誘導(dǎo)溫度，使通過原核表達獲得dsRNA的效率顯著提高。

通過建立原核表達dsRNA的方法，在快速大量獲取VP5同源基因dsRNA后，可利用其特異性抑制VP5蛋白的表達，為進一步分析該蛋白在病毒復(fù)制過程中的作用奠定基礎(chǔ)，同時也為其他病毒蛋白相應(yīng)基因dsRNA的表達提供借鑒。