陳大偉 徐秀章 夏文杰 邵 媛 王嘉勵 劉 靜 鄧 晶 陳揚凱 丁浩強 葉 欣

廣州血液中心(廣州 510095)

近年來，由CD36缺失產生的CD36抗體引起的血小板輸注無效，輸血后紫癜，胎兒/新生兒同種免疫性血小板減少癥以及輸血相關性急性肺損傷屢見報道，嚴重者可以導致患者死亡[1- 3]。根據(jù)本研究組前期研究，我國CD36缺失表達者約2%，其中I型缺失高達0.5%[4]。為了篩查臨床的患者和獻血員，并且對CD36抗體引起的FNAIT及TRALI等進行機制研究，本研究制備了一株鼠抗人CD36單克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞株

6～8周齡CD36基因敲除小鼠B6.129S1-Cd36tm1 Mfe/J，購自美國Jackson公司。穩(wěn)定表達人血小板CD36的HEK293T細胞系，由本實驗室前期構建[5]。本實驗通過醫(yī)院倫理委員會審批，符合動物倫理學要求。

1.2 主要材料與試劑

PEG1500，Sigma 公司；50×HAT、100×HT，Gibico 公司；CD36單克隆抗體FA6-152，Hycult公司；Rapid Antibody Isotyping-Mouse試劑，Pierce公司；BCA protein assay kit，Pierce公司；兔抗鼠IgG-FITC，Dako公司；ECL Plus Western blotting substrate，Pierce公司；Goat anti-mouse IgG (Jackson Immuno Research ；Peroxidase-conjugated Goat anti-human IgG，Jackson Immuno Research公司。

1.3 CD36基因敲除小鼠免疫

利用穩(wěn)定表達人血小板CD36的轉染細胞系HEK293T，經腹腔注射免疫CD36-/-小鼠，共免疫3次，每周1次，每次注射0.5×107個細胞。三次免疫后一周，尾靜脈注射轉染細胞沖擊強化免疫，3～5天后取小鼠尾靜脈血，進行流式細胞檢測，檢查小鼠的免疫情況。

1.4 小鼠血清流式細胞檢測

取免疫3～5天后小鼠尾靜脈血，高速離心留血清20 μL，與表達人血小板CD36的轉染細胞系HEK293T(2.5×105)(陰性對照為轉染空白質粒的HEK293T細胞系，簡稱HEK-MOCK)，4 ℃孵育30 min，PBS洗滌后，細胞懸液與兔抗鼠IgG-FITC二抗(1:50稀釋)孵育，4 ℃避光細胞孵育30 min，PBS重懸后上流式機檢測。

1.5 細胞融合與篩選

經流式細胞技術檢測后，選取效價最高小鼠的脾臟，碾磨后取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0-Ag14)進行細胞融合；經HAT選擇培養(yǎng)，待雜交瘤細胞生長至底面積1/3左右時，吸取細胞培養(yǎng)上清，利用表達人血小板CD36的HEK293T細胞系建立流式檢測方法(陰性對照為HEK-MOCK)，通過流式細胞技術篩選分泌抗人CD36的雜交瘤細胞株。選取流式鑒定陽性的孔，經兩次有限稀釋培養(yǎng)，獲得分泌單抗的雜交瘤細胞株。

1.6 單克隆抗體制備與純化

通過流式細胞技術檢測分泌抗人CD36的雜交瘤細胞，選取其中一株分泌量較高的細胞株擴大培養(yǎng)。首先用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基飼養(yǎng)雜交瘤細胞，待細胞數(shù)充足，轉移至無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周，離心取無細胞培養(yǎng)上清。收集單克隆細胞株的細胞培養(yǎng)上清，并借助Protein G親和層析柱分離純化CD36單克隆抗體，利用BCA法進行蛋白濃度測定。

1.7 單克隆抗體特性鑒定

1.7.1 單克隆抗體亞類鑒定 使用小鼠Ig類/單抗亞類快速檢測試劑盒Rapid Antibody Isotyping進行抗體亞型鑒定。將培養(yǎng)一周的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清50 μL按照1:10進行稀釋，將稀釋后的細胞培養(yǎng)上清150 μL加入反應槽中，室溫孵育10 min觀察結果。

1.7.2 單克隆抗體免疫活性鑒定 收集CD36表達陽性的人血小板，利用細胞裂解液裂解血小板，獲得血小板裂解蛋白溶液，利用BCA法檢測蛋白濃度。取25 μg/道，進行還原SDS-PAGE 電泳(7.5%還原膠)，并將蛋白條帶轉印至 PVDF 膜進行免疫印跡實驗，一抗使用純化的單克隆抗體(1 μg/mL)，二抗使用donkey anti-mouse IgG-HRP(1:2000)，最后使用 HRP 特異性底物 ECL顯色。

1.8 單克隆抗體可用性評價

1.8.1 MAIPA檢測 首先，將羊抗鼠IgG包被在酶標板上，4 ℃孵育過夜。制備EDTA抗凝CD36表達陽性的O型血小板懸液，調整濃度為1×106/μL。將40 μL血小板懸液與25 μL的人血清(CD36抗體陽性兩例和AB型抗體陰性血清1例)進行混勻，37 ℃孵育30 min 。洗滌血小板，除去未結合的血清，加入10 μL的FA6-152或者單克隆抗體(20 μg/mL)，37 ℃孵育30 min。洗滌血小板后，利用100 μL的細胞裂解液在4 ℃條件下，裂解血小板30 min，之后13 000 RPM高速離心后取上清。將血小板裂解液加入之前包被了羊抗鼠IgG的酶標板上，4 ℃孵育90 min。加入過氧化物酶標記的羊抗人IgG，4 ℃孵育120 min。加入反應底物OPD溶液，室溫反應30 min后終止。利用酶標儀讀取492 nm的OD值。

1.8.2 流式細胞檢測 選取CD36表達陰性和陽性的獻血員各一人，抽取5 mL外周血，EDTA抗凝，提取血小板，制備成血小板懸液。將血小板(5.0×105)與0.05 μg的單克隆抗體在4 ℃條件下孵育30 min，陽性對照為單抗FA6-152，EDTA/PBS洗滌血小板后，二抗使用兔抗鼠IgG-FITC(1:50稀釋)，4 ℃避光孵育30 min，血小板洗滌后重懸上流式機檢測。流式細胞檢測數(shù)據(jù)使用軟件FlowJo software進行分析。

2 結 果

2.1 雜交瘤細胞篩選

細胞融合后，將細胞種植于6個96孔板中。經HAT選擇培養(yǎng)后，355孔出現(xiàn)細胞克隆(陽性率355/576=61.6%)。待雜交瘤細胞生長至底面積1/3左右時，吸取細胞培養(yǎng)上清，利用表達人血小板CD36的HEK293T細胞系建立流式檢測方法，陰性對照為轉染空白質粒的HEK293T細胞系(HEK-MOCK)，流式鑒定抗體陽性的有173孔(陽性率為173/355=48.7%)。選擇其中一株陽性較強的雜交瘤細胞，經兩次有限稀釋培養(yǎng)，獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

2.2 單克隆抗體亞型鑒定

由鑒定卡的結果可知，單克隆抗體的亞型為IgG2a，輕鏈為κ鏈。見圖1。

圖1 單克隆抗體亞型鑒定結果圖

2.3 抗體免疫活性鑒定

經western blot檢測，在相對分子質量約90KD處有一條蛋白條帶，與CD36分子的大小相對一致。見圖2。

圖2 人血小板裂解液與單克隆抗體western blot鑒定結果1：單克隆抗體；2：mouse IgG

2.4 MAIPA檢測

根據(jù)MAIPA的結果，兩例CD36陽性的血清中，其中1例血清FA6-152與單克隆抗體檢測的OD值相當。另外1例CD36抗體陽性血清CYC，單克隆抗體檢測的OD值遠高于商業(yè)化的抗體FA6-152，靈敏度更高，可以用于臨床CD36抗體的檢測。見表1。

表1 AB型抗體陰性血清和CD36抗體陽性血清MAIPA檢測結果

2.5 人血小板CD36表達流式細胞檢測

圖3 人血小板流式細胞鑒定結果注：①：CD36表達缺失的人血小板；②：CD36表達陽性的人血小板A：FA6-152抗體的流式結果；B：單克隆抗體的流式結果

由血小板流式細胞鑒定結果可知，此單克隆抗體可以特異性識別人血小板CD36蛋白的表達情況，可以用于臨床CD36表達缺失獻血員的篩選。

3 討 論

CD36，又稱GPIV(glycoprotein IV)，是相對分子量為88KD的跨膜糖蛋白，廣泛表達于多種組織和細胞表面，如血小板、單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞和上皮細胞等[6]。根據(jù)本研究組前期研究，我國CD36缺失表達者約2%，其中I型缺失高達0.5%[4]。2011年以來，本中心發(fā)現(xiàn)并報道了5例由CD36抗體引起PTR,FNAIT的病例[7- 8]。本中心還成功的為1例FNAIT的孕婦進行宮內輸注CD36陰性的血小板和紅細胞，糾正了胎兒的血小板減少癥，使其成功的產下健康的胎兒[9]。本研究成功制備了鼠抗人CD36單克隆抗體，可以用于檢測獻血員血小板CD36抗原的表達，為CD36表達缺失的患者提供CD36抗原相容的血小板，對于我國臨床輸血的安全性及血小板免疫性疾病的診斷都有重要的意義。

自從1975年B細胞雜交瘤技術發(fā)展以來，單克隆抗體(mAbs)作為開發(fā)疫苗、診斷和治療以及一般研究工具的應用已經越來越廣泛[10-12]。有研究描述了一種高效的策略來快速產生小鼠單克隆抗體來對登革熱病毒抗原。該策略是以人胚腎(HEK)懸浮細胞系293F為載體，將目的蛋白作為含有跨膜結構域的融合蛋白進行轉染，從而使HEK細胞表面的大量嵌合膜結合靶抗原以天然的構象呈現(xiàn)給用于轉染細胞免疫的動物的免疫系統(tǒng)。利用這種新的免疫策略，可以快速高效地產生雜交瘤細胞系，產生針對登革熱病毒抗原的單克隆抗體[13-14]。利用HEK細胞作為表達天然蛋白的工具有幾個優(yōu)點。首先，HEK細胞很容易在培養(yǎng)液中生長，可以有效地用商用轉染試劑轉染，也可以表達大量的重組蛋白[15]。我們研究組通過提取人血小板總RNA，逆轉錄獲得cDNA，經PCR擴增后獲得人血小板的CD36基因片段，TA克隆后轉化TOP10 E.coli，藍白斑篩選獲得陽性重組子pcDNA3.1/V5-CD36，將序列一致的質粒DNA轉染HEK293T細胞，獲得穩(wěn)定表達人血小板CD36的HEK293T轉染細胞[5]。本研究成功利用已建立的穩(wěn)定表達人血小板CD36的HEK293T細胞系對小鼠進行免疫，并成功獲得穩(wěn)定分泌鼠抗人CD36單克隆抗體的雜交瘤細胞株。經過單克隆抗體免疫活性鑒定，證實該單克隆抗體對人血小板CD36抗原有特異性結合。經人血小板流式細胞檢測，該單克隆抗體可以用于人血小板CD36表達的鑒定。這對于臨床上篩選CD36表達缺失的獻血員有重要意義。

目前，針對血小板表面糖蛋白抗體的檢測有很多種，各有優(yōu)缺點。血小板抗原單克隆抗體特異性免疫固定檢測(MAIPA)作為ISBT推薦的檢測血小板抗體的金標準，一直是被廣泛認可的。MAIPA最大的優(yōu)點是能檢測出HPA抗體的特異性，因為血小板糖蛋白與待測血清以及對應鼠源單抗反應時能保持天然構象，其抗原性沒有受到任何破壞。因此，MAIPA也成為ISBT 血小板免疫學研討會質控項目的指定檢測方法[16]。目前，也有很多國外的實驗室對MAIPA方法的改良的報道[17-18]。本研究利用特異性的鼠抗人CD36單克隆抗體建立的MAIPA，成功檢測出CD36抗體陽性的血清標本，與商品化單抗FA6-152相比，OD值更高，檢測靈敏度更高。因此，利用此單克隆抗體建立的MAIPA去鑒定血清中的CD36抗體具有重要的臨床意義，對于血小板輸注無效、新生兒同種免疫性血小板減少癥等疾病的診斷具有較高的應用價值。