李任峰，田香勤，韓 笑，王曉斐，姜金慶，夏小靜，王異民，王自良

（1.河南科技學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 河南省醫(yī)用組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng) 453003）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是引起豬腹瀉的主要病原體，發(fā)病豬以嘔吐、腹瀉、食欲下降和脫水為主要特征，特別是7日齡以內(nèi)仔豬感染PEDV死亡率可達(dá)80%～100%[1]。1971年，英國(guó)最先報(bào)道豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）疫情，隨后證實(shí)其病原體為PEDV[2]。此后，PEDV在歐洲的許多國(guó)家以及亞洲的日本、韓國(guó)、泰國(guó)及越南等國(guó)家迅速流行。2013年5月美國(guó)暴發(fā)PED疫情，導(dǎo)致一年內(nèi)近800萬(wàn)頭仔豬死亡，疫情很快傳播到加拿大和墨西哥，造成當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)損失慘重[3]。近年來(lái)，PEDV的流行和進(jìn)化更趨復(fù)雜化，在俄羅斯和意大利北部分別發(fā)現(xiàn)了PEDV與豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）的重組毒株[4-5]，我國(guó)也存在PEDV重組毒株流行[6-8]。當(dāng)前，PEDV仍是威脅養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要病源之一，防控形勢(shì)嚴(yán)峻。

PEDV屬于尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）當(dāng)中的冠狀病毒Ⅰ群成員，具有與冠狀病毒科其他成員相似的病毒粒子形態(tài)[9]。PEDV基因組核酸類型為線性、單股的正鏈RNA，全長(zhǎng)約28 000 nt，5'和3'端分別有帽子結(jié)構(gòu)（cap）和Poly（A）尾。其編碼的結(jié)構(gòu)蛋白包括4種：纖突（spike glycoprotein，S）蛋白，膜（membrane，M）蛋白，核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白和小膜（small membrane）蛋白，非結(jié)構(gòu)蛋白有3種：ORF3、復(fù)制酶la和1b。其中，N蛋白由441個(gè)氨基酸組成，分子量約為85 kDa，主要作用是與病毒的RNA互相纏繞形成病毒的核衣殼，同時(shí)，N蛋白也是PEDV主要的結(jié)構(gòu)蛋白。豬在感染PEDV后，體內(nèi)較早產(chǎn)生抗N蛋白抗體，再加上N蛋白的進(jìn)化較為保守。因此，N蛋白常被作為靶蛋白用于PEDV的早期診斷[10-11]。本研究通過(guò)對(duì)N基因克隆表達(dá)，并制備針對(duì)N蛋白的單克隆抗體，對(duì)后續(xù)建立PEDV的診斷方法具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 原核表達(dá)載體pET-28a(+)購(gòu)自Novagen公司；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；pMD19T-N重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，其N蛋白基因序列來(lái)源于毒株CH/HNQX-3/14（GenBank登錄號(hào)：KR095279.1；6～8周齡的雌性BALB/c小鼠購(gòu)自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 以pMD19T-N基因序列為模板，用Primer Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，用于擴(kuò)增N基因全長(zhǎng)序列，上游引物：5'-CGCGGATCCGC TTCTGTCAGCTTT-3'，下游引物：5'-CGCGAGCT CTTAATTTCCTGTATCGAAGAT-3'；在上、下游引物序列中分別引入BamH I和SacI酶切位點(diǎn)（下劃線），該引物擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為1326 bp，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 主要試劑及耗材 限制性內(nèi)切酶、Premix ExTaqDNA聚合酶、DNA marker、T4 DNA連接酶以及分子克隆所用其他試劑均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和IPTG購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG購(gòu)自Abbkine公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；Superdex75凝膠層析預(yù)裝柱購(gòu)自GE Healthcare Bio-Science AB公司。

1.4 重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 以pMD19T-N質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增N蛋白全長(zhǎng)基因，反應(yīng)體系（20 μL）：模板pMD19T-N（200～400 ng/μL）1.0 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL，PreMixTaq10 μL，ddH2O 8 μL；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。將上述的PCR回收純化產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pET28a(+)分別用BamH I和SacI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)回收純化后加入T4 DNA連接酶于16℃連接過(guò)夜，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR及酶切鑒定。

1.5 重組N蛋白的表達(dá)與純化 將轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性重組菌落接種于卡那抗性（100 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)至菌液D600值達(dá)到0.6時(shí)，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG，在25℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)20 h，收集IPTG誘導(dǎo)前后的菌液，8900×g離心15 min，收集菌體沉淀，用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸沉淀，于-80℃與室溫之間反復(fù)凍融3次，在冰浴條件下超聲破碎后離心收集上清液，SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)蛋白。采用Ni-NTA親和層析預(yù)裝柱純化重組N蛋白，所用洗滌液為含300 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4、50 mmol/L Imidazole、pH 8.0的Washing Buffer，洗脫液為含300 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4、250 mmol/L Imidazole、pH 8.0的Elution Buffer。Superdex75凝膠層析純化N蛋白過(guò)程按照GE公司提供的產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。采用SDS-PAGE及Western blot鑒定純化后的蛋白，并進(jìn)行定量分析。

1.6 抗N蛋白單克隆抗體的制備與鑒定 將純化后的重組N蛋白與弗氏佐劑按1∶1體積比乳化（初次免疫用弗氏完全佐劑，再次免疫用弗氏不完全佐劑），乳化后的蛋白經(jīng)皮下多點(diǎn)注射6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，多次免疫后選取抗體效價(jià)較高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合過(guò)程參考文獻(xiàn)[12-13]方法進(jìn)行，具體為：將SP2/0骨髓瘤細(xì)胞（107）與超免小鼠脾臟B細(xì)胞（108）于離心管中混合，離心除去上清液。在1 min內(nèi)緩慢滴入預(yù)溫至37℃的50%PEG 0.8 mL，邊加邊用吸管尖輕輕攪拌管底的沉淀，然后緩慢加入37℃預(yù)溫的1640基礎(chǔ)液終止反應(yīng)，1000×g離心5 min，棄上清液，用含HAT的1640培養(yǎng)基混懸，混懸后的細(xì)胞按100 μL/孔加到96孔板中，將細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合10 d左右進(jìn)行篩選檢測(cè)。分別用重組N蛋白和PEDV病毒液作為包被原，SP2/0細(xì)胞上清液為陰性對(duì)照，采用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。將陽(yáng)性克隆雜交瘤細(xì)胞（1×106/只）注射小鼠腹腔（小鼠提前腹腔注射滅菌液體石蠟）誘生腹水，采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水單抗，采用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定其亞型；按以下公式計(jì)算其抗體親和常數(shù)：Ka=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)，其中n為包被抗原2個(gè)不同濃度的比值，[Ab']t、[Ab]t分別為2個(gè)不同濃度抗原包被下D450的50%所對(duì)應(yīng)的單克隆抗體濃度。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以質(zhì)粒pMD19T-N為模板對(duì)N基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可在1326 bp左右觀察到1條明顯的條帶，與預(yù)期大小一致（圖1）。將PCR產(chǎn)物回收，經(jīng)雙酶切后與載體質(zhì)粒pET-28a(+)連接并轉(zhuǎn)化DH5α，挑取菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定后測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的片段與表達(dá)載體pET28a(+)連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，挑取單菌落培養(yǎng)后，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到一條1326 bp左右的片段（圖2A）；采用BamH I和SacI雙酶切鑒定，可見分別為5400 bp和1326 bp左右的2條片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2B），將該重組質(zhì)粒命名為pET28a-N。

圖1 PEDV N基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplication of PEDV N gene

圖2 N基因PCR擴(kuò)增（A）和雙酶切鑒定（B）結(jié)果Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid pET28a(+)-N (A) and restriction enzyme digestion (B)

2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將pET28a(+)-N重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，挑取單菌落于37℃活化至菌液D600值達(dá)到0.6左右時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)取誘導(dǎo)前菌液作為對(duì)照，用15%的甘油保菌。并分別對(duì)IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定在25℃條件下，以0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)20 h蛋白表達(dá)量最大，且主要以可溶性形式存在。SDS-PAGE結(jié)果證實(shí)該蛋白的相對(duì)分子量在54 kDa左右，與目的條帶大小相符（圖3）。

圖3 重組N蛋白的SDA-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant N protein

2.3 重組N蛋白的純化 首先采用Ni-NTA親和層析對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，為了確定最佳洗脫濃度，采用不同濃度的咪唑?qū)χ亟MN蛋白進(jìn)行梯度洗脫，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明：250 mmol/L的咪唑?yàn)樽罴训鞍紫疵摑舛?。?jīng)鎳柱純化后，N蛋白條帶以上（分子量大于N蛋白）的雜蛋白已基本除去，但分子量小于N蛋白的雜蛋白仍然存在，于是我們將經(jīng)鎳柱純化后的蛋白先用30 kDa的超濾濃縮管濃縮，再用Superdex 75凝膠柱分子篩對(duì)N蛋白做進(jìn)一步純化。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明：純化后的蛋白大小約為54 kDa，與目的蛋白大小相符（圖4A）。Western blot結(jié)果顯示：該蛋白與PEDV陽(yáng)性血清及His單抗均能發(fā)生免疫反應(yīng)，具有較好的反應(yīng)活性（圖4B），BCA法定量純化后蛋白的濃度為1.2 mg/mL，能夠滿足后期免疫要求。

圖4 純化重組N蛋白SDS-PAGE (A)和Western blot (B)鑒定Fig.4 SDS-PAGE(A) and Western blot(B) identification of purified N protein

2.4 抗N蛋白單克隆抗體的制備與鑒定 以純化的重組N蛋白為抗原，乳化后免疫BALB/c小鼠，選取效價(jià)較高的4號(hào)小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后第7 d觀察到細(xì)胞融合率達(dá)85%以上。采用間接ELISA方法經(jīng)過(guò)3輪亞克隆篩選獲得了9株能分泌N蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其中2株能與PEDV特異性結(jié)合，分別命名為1A3和4F6，其腹水效價(jià)分別達(dá)到5.12×105和1.28×105。采用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對(duì)以上單抗的亞型進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：兩株單克隆抗體的重鏈均為IgG1，輕鏈均為kappa型。

2.5 抗N蛋白單克隆抗體親和力測(cè)定 分別以1.0 μg/mL和2.0 μg/mL的重組N蛋白包被酶標(biāo)板，采用間接ELISA方法測(cè)定1A3和4F6兩株單克隆抗體的效價(jià)，酶標(biāo)儀讀取D450，以單克隆抗體的濃度為橫坐標(biāo)、D值為縱坐標(biāo)制作反應(yīng)曲線；選取曲線上部趨于平坦段的D值作為100%，計(jì)算出50%的D值所對(duì)應(yīng)的單抗?jié)舛?，代入親和常數(shù)公式進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，1A3和4F6的McAb與N蛋白抗原結(jié)合達(dá)到50%飽和所需單克隆抗體濃度分別為1.56 μg/mL和0.74 μg/mL，根據(jù)親和常數(shù)公式計(jì)算出1A3和4F6的親和常數(shù)（Ka）分別為3.88×1011和5.13×1011（L/mol）（親和常數(shù)在107～1012L/mol時(shí)表明抗體親和力較高），表明兩株單克隆抗體均具有較高的親和力。

圖5 1A3和4F6單克隆抗體亞型鑒定Fig.5 Identification of 1A3 and 4F6 McAb subtypes

圖6 1A3和4F6單克隆抗體親和力分析Fig.6 Affinity analysis of 1A3 and 4F6 McAb

3 討論

P E D V與豬傳染性胃腸炎病毒（P o r c i n e transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、豬δ冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）、貓傳染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV）、人冠狀病毒（Human coronavirus，HCoVNL6）和嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒（Severe acute respiratory syndrome, SARS-CoV）同屬冠狀病毒科成員，其N蛋白功能相似，通過(guò)包裝病毒基因組RNA形成核糖核蛋白，N蛋白在病毒組裝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并參與病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯，調(diào)控病毒的增殖[14-16]。另外，PEDV的N蛋白通過(guò)阻斷核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）入核或阻止IRF3和TBK1之間的相互作用，從而拮抗γ-干擾素或β-干擾素的產(chǎn)生，有利于病毒逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊[17-18]。更重要的是，在PEDV感染早期，動(dòng)物體內(nèi)即產(chǎn)生高水平的抗N蛋白抗體。因此，N蛋白常作為PEDV的診斷抗原用于PEDV的早期診斷。

Wang等[19]的研究表明，PEDV的N蛋白含有2個(gè)保守的抗原表位區(qū)，分別位于18～133 aa和252～262 aa。序列分析結(jié)果顯示：這兩個(gè)表位在不同的PEDV分離毒株中高度保守，且與冠狀病毒科的其他成員存在明顯差異。Xie等[20]研究發(fā)現(xiàn)，PEDV的N蛋白氨基端殘基58-RWRMRRGERIE-68和78-LGTGPHAD-85與TGEV的抗血清容易形成交叉反應(yīng)，在建立診斷方法時(shí)應(yīng)注意二者的區(qū)分。Yang等[21]通過(guò)克隆PEDV的全長(zhǎng)N基因，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行重組表達(dá)，并制備了6株抗N蛋白單克隆抗體，為建立PEDV的診斷方法奠定了良好基礎(chǔ)。鄭逢梅等[22]根據(jù)N蛋白的抗原性分析結(jié)果，將N蛋白上兩個(gè)大的抗原表位區(qū)（112-321 aa）克隆至原核表達(dá)載體pET-32a，構(gòu)建pET-32a-N重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21中獲得了高效表達(dá)，以重組N蛋白為抗原建立了檢測(cè)PEDV抗體的間接ELISA方法，結(jié)果表明，建立的間接ELISA方法特異性、靈敏性和可重復(fù)性良好，可用于臨床上PEDV抗體水平的監(jiān)測(cè)和PED流行病學(xué)調(diào)查。本研究利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出了PEDV完整N蛋白基因片段，構(gòu)建了pET28a(+)-N表達(dá)載體，通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達(dá)，并篩選獲得了2株穩(wěn)定分泌抗N蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為下一步開展N蛋白功能研究、抗原性分析以及建立基于N蛋白的PEDV診斷方法奠定了重要基礎(chǔ)。