唐 娜，楊 慧，劉 磊，張松林，于 雪，孫培姣，沈志強(qiáng),，肖躍強(qiáng)

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州256600；2.山東綠都生物科技有限公司，濱州256600）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種以母豬繁殖障礙和各日齡豬呼吸疾病為特征的接觸性傳染病，是世界范圍經(jīng)濟(jì)危害最為嚴(yán)重的豬病毒傳染性疾病之一，每年導(dǎo)致美國(guó)養(yǎng)豬行業(yè)損失約6.64億美元[1]。該病1987年在美國(guó)首先被報(bào)道，20世紀(jì)90年代傳入我國(guó)并廣泛流行[2]。從最初的經(jīng)典型PRRSV流行到2006年暴發(fā)的由高致病性PRRSV（highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV）引起的“豬高熱病”（農(nóng)醫(yī)發(fā)[2007]10號(hào)），再到近幾年開始流行的類NADC-30毒株引發(fā)的PRRS，以及病毒自然重組導(dǎo)致的變異毒株等，該病嚴(yán)重危害了我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3-8]。

PRRSV是動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae）動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus）成員，基因組約為15.4 kb的單股正鏈RNA，包含至少10個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF），側(cè)翼為5'端和3'端非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR），且3'端有poly（A），具體組織結(jié)構(gòu)為：5'UTR-ORF1a-ORF1b-ORF2a-ORF2b-ORF3-ORF4-ORF5/ORF5a-ORF6-ORF7-3'UTR。ORF1a和ORF1b編碼的2個(gè)多聚蛋白通過病毒酶解離產(chǎn)生14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[9]；ORF2至ORF7編碼8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：GP2、E、GP3、GP4、GP5a、GP5、M和N[10]，由一系列嵌套的亞基因組mRNA表達(dá)（subgenomic mRNA，sg mRNA），sg mRNA是在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列（transcription-regulating sequences，TRS）引導(dǎo)下，來源于病毒轉(zhuǎn)錄期間負(fù)鏈RNA的不連續(xù)合成[11-13]。PRRSV感染性克隆可作為表達(dá)載體，在TRS的控制下，外源基因可以作為單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄單位實(shí)現(xiàn)表達(dá)，構(gòu)建病毒載體疫苗[14-17]。

本研究首先構(gòu)建了PRRSV XZ06株[18]傳代致弱毒株XZ06a感染性克隆，并以此為骨架引入ORF6 TRS與酶切位點(diǎn)，克隆插入增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP），拯救獲得了能夠表達(dá)EGFP的重組PRRSV，為開展病毒感染致病機(jī)制、重組疫苗構(gòu)建等奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要病毒株、菌株、載體 PRRSV XZ06a株、Marc-145細(xì)胞、pEGFP-C1、pCAGEN載體、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α等由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 Lipo 2000、Opti-MEM、SuperScriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶、Phusion Flash High-Fidelity PCR Mix、PageRulerTM預(yù)染蛋白marker、GeneJET Viral DNA/RNA提取試劑盒、GeneJET Plasmid小量制備試劑盒、GeneJET Gel Extraction試劑盒、β-actin mAb、GFP Tag mAb、HRP標(biāo)記Goat anti-Mouse IgG、HRP標(biāo)記Goat anti-Rabbit IgG等購(gòu)自Thermo Scientific公司；DL15 000、DL2000 DNA marker、pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase購(gòu)自NEB公司；針對(duì)PRRSV M蛋白單克隆抗體由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所蔡雪輝研究員惠贈(zèng)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與基因合成

1.3.1 PRRSV XZ06a感染性克隆構(gòu)建引物 根據(jù)PRRSV JXA1株（EF112445）基因組序列，將基因組分為F1～F4共4段進(jìn)行克隆。改造pCAGEN載體多克隆位點(diǎn)EcoRⅠ與NotⅠ之間序列為5'-SmaⅠ-AfeⅠ-NheⅠ-AscⅠ-PmeⅠ-3'序列，即序列為MCS-1/2，改造后命名為pCA，并利用EcoRⅠ與SmaⅠ插入錘頭樣核酶序列（HHRz），同時(shí)人工合成HDVRz。引物均使用Primer Premier 5.0軟件輔助設(shè)計(jì)，引物與基因均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列見表1。

1.3.2 表達(dá)EGFP重組PRRSV感染性克隆構(gòu)建引物 選擇PRRSV XZ06a基因組ORF1b與ORF2之間（11 981 nt～11 983 nt），插入ORF6 TRS序列，同時(shí)選擇基因組NheⅠ（7608 nt）與EcoRⅤ（12 072 nt）區(qū)段，經(jīng)PCR擴(kuò)增、基因組外拼接、基因組替換等引入酶切位點(diǎn)PacⅠ與MluⅠ，構(gòu)建含有PacⅠ與MluⅠ酶切位點(diǎn)感染性克隆，然后以pEGFP-C1模板，PCR克隆EGFP基因，并插入對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)，構(gòu)建攜帶EGFP基因的病毒感染性克隆。引物同樣使用Primer Premier 5.0軟件輔助設(shè)計(jì)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列見表1。

1.4 病毒基因組提取與cDNA合成 根據(jù)GeneJET Viral DNA/RNA提取試劑盒說明書提取病毒基因組RNA，溶于DNA/RNAase free水，75℃水浴變性5 min，冰浴條件下，依次加入Oligo(dT)18、Random Hexamers、反轉(zhuǎn)錄酶Buffer、dNTP、Rnasin、SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶，50℃反應(yīng)60 min合成cDNA，95℃加熱5 min滅活。

1.5 病毒基因組PCR克隆 使用Phusion Flash高保真PCR預(yù)混液擴(kuò)增病毒基因組，擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性10 s，98℃變性1 s，根據(jù)引物選擇53℃～57℃退火5 s，72℃延伸30 s～90 s（1 kb/15 s），共30個(gè)循環(huán)。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.6 感染性克隆構(gòu)建策略 以合成HDVRz為模板，引物3-HDV-F/R克隆后與F4搭橋擴(kuò)增獲得攜帶HDVRz的F4-HDV；根據(jù)改造的多克隆位點(diǎn)與基因組序列酶切位點(diǎn)分布，感染性克隆構(gòu)建插入順序依次為F1、F2、F4-HDV與F3，構(gòu)建的感染性克隆命名為pCA-XZ06a。

1.7 酶切位點(diǎn)引入與攜帶EGFP基因感染性克隆構(gòu)建引物對(duì)XZ11983TRS-F（融合PRRSV ORF6 TRS序列）、XZ12101-R與XZ7594-F、XZ11982-R分別擴(kuò)增基因組，依次克隆入pMD18-T，引入了PacⅠ與MluⅠ克隆位點(diǎn)，經(jīng)NheⅠ/EcoR Ⅴ雙酶切后替換PRRSV XZ06a感染性克隆對(duì)應(yīng)區(qū)段，構(gòu)建攜帶酶切位點(diǎn)的感染性克隆，引物XZ11520-F/XZ12753-R擴(kuò)增，PacⅠ/MluⅠ分別酶切鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，并將鑒定正確的克隆命名為pCA-XZ06∧；以pEGFP-C1為模板，PCR方法克隆EGFP基因，進(jìn)行PacⅠ/MluⅠ雙酶切，插入攜帶酶切位點(diǎn)的感染性克隆，構(gòu)建攜帶EGFP基因的感染性克隆，命名為pCAXZ06a∧EGFP。

1.8 重組病毒的拯救 提取pCA-XZ06a、pCAXZ06a∧、pCA-XZ06a∧EGFP重組質(zhì)粒，測(cè)定濃度，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量為1 μg/孔，轉(zhuǎn)染介質(zhì)為L(zhǎng)ipo 2000，二者比例為1∶5（W∶V），具體操作按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48 h后，每日觀察細(xì)胞病變，同時(shí)熒光顯微鏡觀察EGFP熒光，確定病毒是否拯救成功。

1.9 重組病毒EGFP的表達(dá)檢測(cè) 收獲感染Marc-145細(xì)胞5、8、16、24、48 h時(shí)間點(diǎn)重組病毒，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，以針對(duì)PRRSV M蛋白單克隆抗體、Anti-GFP mAb的單抗分別為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光收集酶促反應(yīng)信號(hào)。

1.10 重組病毒的增殖與噬斑純化 待細(xì)胞出現(xiàn)CPE比例60%以上時(shí)收獲，反復(fù)凍融3次，傳代培養(yǎng)，表達(dá)EGFP重組病毒每傳3代進(jìn)行克隆純化，連續(xù)純化3次，持續(xù)傳代，并測(cè)定第10代重組病毒滴度TCID50。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV基因組克隆 基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，成功克隆了PRRSV XZ06a全基因組，所克隆的F1～F4段產(chǎn)物大小分別為2213 bp、5493 bp、4345 bp與3460 bp，與預(yù)期一致。

2.2 PRRSV XZ06a感染性克隆構(gòu)建 測(cè)序證實(shí)pCA改造載體EcoRⅠ與SmaⅠ之間成功插入HHRz序列，然后XhoⅠ（HHRz序列引入）與AfeⅠ雙酶切克隆插入F1片段，AfeⅠ/NheⅠ雙酶切插入F2片段，AscⅠ/NotⅠ雙酶切插入F4-HDV片段，最后NheⅠ/AscⅠ雙酶切插入片段F3，測(cè)序結(jié)果顯示，正確構(gòu)建了DNA-launched感染性克隆pCA-XZ06a。

圖1 PRRSV XZ06a株基因組擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification products of PRRSV XZ06a strain genome

2.3 酶切位點(diǎn)引入與基因組置換 引物XZ11983TRS-F（融合PRRSV ORF6 TRS序列）與XZ12101-R、XZ7594-F與XZ11982-R分別擴(kuò)增獲得預(yù)期為158 bp、4388 bp產(chǎn)物，電泳結(jié)果見圖2、3；依次克隆入pMD18-T，并經(jīng)測(cè)序鑒定成功引入酶切位點(diǎn)PacⅠ與MluⅠ，替換后PRRSV XZ06a感染性克隆對(duì)應(yīng)區(qū)段。引物對(duì)XZ11520-F/XZ12753-R擴(kuò)增產(chǎn)物大小、PacⅠ/MluⅠ酶切產(chǎn)物大小均與預(yù)期大小一致，電泳結(jié)果見圖4；NheⅠ/EcoRⅤ雙酶切產(chǎn)物為15 832 bp和4500 bp，電泳結(jié)果見圖5，成功構(gòu)建了攜帶酶切位點(diǎn)的感染性克隆pCA-XZ06a∧。

2.4 攜帶EGFP基因感染性克隆構(gòu)建 PCR方法克隆EGFP基因，大小為726 bp，PacⅠ/MluⅠ分別雙酶切EGFP基因與pCA-XZ06a∧，經(jīng)連接、抗性篩選、測(cè)序鑒定獲得攜帶EGFP基因的病毒感染性克隆pCAXZ06a∧EGFP。

2.5 重組病毒的拯救 感染性克隆pCA-XZ06a、pCA-XZ06a∧轉(zhuǎn)染后4～5 d即出現(xiàn)PRRSV特征性病變，而pCA-XZ06a∧EGFP出現(xiàn)特征性病變時(shí)間有所延遲，一般5～7 d出現(xiàn)病變，出現(xiàn)的病變與GFP表達(dá)如圖6所示。獲得的拯救病毒依次命名為rCA-XZ06a、rCA-XZ06a∧和rCA-XZ06a∧EGFP。

圖2 引物XZ11983TRS-F/XZ12101-R PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The electrophoresi figure of PCR products amplified with primers XZ11983TRS-F and XZ12101-R

圖3 引物XZ7594-F/XZ11982-R PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 The electrophoresi figure of PCR products amplified with primers XZ7594-F and XZ11982-R

2.6 表達(dá)EGFP重組PRRSV噬斑純化 對(duì)重組病毒rCA-XZ06a∧EGFP進(jìn)行噬斑純化，結(jié)果見圖6。挑取能夠表達(dá)EGFP的噬斑擴(kuò)大培養(yǎng)，傳至25代，重組病毒病變?cè)钆cEGFP發(fā)光團(tuán)完全匹配，最終獲得能夠穩(wěn)定傳代表達(dá)EGFP的重組病毒。

2.7 重組病毒EGFP表達(dá)檢測(cè) 重組病毒rCA-XZ06a∧EGFP感染Marc-145細(xì)胞后第5、8、16、24、48 h時(shí)進(jìn)行EGFP表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果見圖7。表明EGFP表達(dá)產(chǎn)物在重組蛋白感染Marc-145后第16 h能最初檢測(cè)到，隨著感染時(shí)間增加，蛋白表達(dá)量升高；病毒M蛋白檢測(cè)結(jié)果與EGFP一致。

圖4 引物XZ11520-F/XZ12753-R PCR與酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.4 The electrophoresi figure of PCR and digestion products amplified with primers XZ11520-F and XZ12753-R

圖5 重組質(zhì)粒pCAGEN- XZ06a∧酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.5 The electrophoresi figure of digest products of the plasmid pCA-XZ061201a∧

2.8 重組病毒生長(zhǎng)曲線 以0.1 MOI感染Marc-145細(xì)胞，收獲感染12、24、36、48、60、72與84 h重組病毒，測(cè)定其TCID50，生長(zhǎng)曲線如圖8所示，拯救獲得的rCA-XZ06a、rCA-XZ06a∧EGFP與親本PRRSV相比，病毒增殖趨勢(shì)基本一致，但pCA-XZ06a∧EGFP病毒滴度略微降低。

3 討論

圖6 重組病毒rCA-XZ06a∧EGFP拯救與EGFP表達(dá)（200×）Fig.6 Rescue of rCA-XZ06a∧EGFP and expression of EGFP (200×)

圖7 rCA-XZ06a∧EGFP感染EGFP表達(dá)動(dòng)態(tài)檢測(cè)Fig.7 Detection of EGFP at the time points infected with rCA-XZ06a∧EGFP expressing the EGFP

圖8 病毒生長(zhǎng)曲線Fig.8 Growth kinetics of the parental virus, recombinant virus and recombinant virus expressing EGFP

利用反向遺傳操作技術(shù)，建立PRRSV感染性克隆并表達(dá)外源基因已開展了大量研究，插入位點(diǎn)主要包括病毒Nsp2基因內(nèi)部、ORF1b與ORF2之間、ORF7與3'UTR之間，F(xiàn)ang[19]、Wang[20]、Han[21]等均將EGFP基因與Nsp2基因融合表達(dá)，獲得了能夠表達(dá)EGFP的重組病毒，但Fang等[19]將基于北美1型PRRSV的重組病毒在Marc-145細(xì)胞傳至第7代時(shí)，有15%比例重組病毒無(wú)法觀察到EGFP，對(duì)其誘因的研究表明，病毒在傳代過程無(wú)法觀察到EGFP是因?yàn)樵谠摰鞍譔末端1～159氨基酸序列缺失的同時(shí)，在160氨基酸殘基前額外插入了2個(gè)氨基酸殘基；同樣，Han等[21]也發(fā)現(xiàn)隨著病毒傳代，熒光逐漸消失；Pei等[14]將EGFP基因插入ORF1b與ORF2a之間，傳37代后重組病毒保持表型穩(wěn)定。本研究構(gòu)建了攜帶ORF6 TRS序列重組PRRSV毒株，將EGFP基因插入至ORF1b與ORF2之間，在傳代過程中發(fā)現(xiàn)有的病變?cè)顭o(wú)法觀察到熒光，因此進(jìn)行了連續(xù)噬斑克隆純化，傳至25代病毒保持了遺傳穩(wěn)定性，EGFP能夠穩(wěn)定表達(dá)。因此，作者認(rèn)為影響外源基因插入后穩(wěn)定傳代表達(dá)的因素較為復(fù)雜，包括插入位點(diǎn)、目的基因大小、表達(dá)產(chǎn)物對(duì)病毒復(fù)制的影響等，病毒為了保持自身的遺傳特性，通過未知機(jī)制破壞外源基因的完整性或者干擾其轉(zhuǎn)錄翻譯。

將PRRSV作為病毒載體構(gòu)建重組病毒，表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）、豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）等免疫保護(hù)性蛋白基因或者中和抗原表位[22-28]，以及表達(dá)IL-4、GM-CSF、IFN等細(xì)胞因子[15-17]，除了表達(dá)IFN基因能夠明顯抑制病毒的復(fù)制，其他重組病毒均獲得良好的增殖效率。最新研究成果表明[23]，以PRRSV致弱毒株DS722同時(shí)重組表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型與豬流感病毒，構(gòu)建了“三價(jià)”疫苗并免疫豬，用PRRSV攻擊，肺損傷和病毒RNA載量顯著減少，用PCV2攻擊，淋巴器官病變和病毒DNA載量部分減少，當(dāng)用SIV攻擊時(shí)，免疫豬急性呼吸癥狀顯著降低，該研究結(jié)果表明PRRSV可作為潛在的活病毒疫苗載體開展探索研究。本研究應(yīng)用病毒載體系傳代致弱毒株，源于具有高致病性PRRSV顯著特點(diǎn)的毒株，即Nsp2基因缺失90個(gè)核苷酸（2779～2781 nt、2933～3019 nt分別連續(xù)缺失3個(gè)、87個(gè)核苷酸[18,29-31]），構(gòu)建感染性克隆，并將EGFP基因插入ORF1b與ORF2之間，能夠高效表達(dá)EGFP，為進(jìn)一步開發(fā)疫苗制劑奠定基礎(chǔ)。

總之，本研究構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)EGFP的重組PRRSV毒株，為開展PRRSV病毒復(fù)制機(jī)制、感染特性、致病機(jī)制、疫苗開發(fā)等研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。