杜 靜 呂 樂

（[1]首都師范大學(xué)附屬育新學(xué)校 北京 100096；[2]北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院 北京 100083）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為一種微小的單細胞真菌，在食品發(fā)酵方面已有十分悠久的使用歷史，其兼性厭氧特性和產(chǎn)酸產(chǎn)氣能力被利用作為食品發(fā)酵劑。釀酒酵母作為酵母屬中的重要組成部分，被廣泛使用于果酒的發(fā)酵中。[1]釀酒酵母的生長能力強且具有益生作用，對人體無毒害，適合作為高中生物課程的實驗材料。

1 酵母種群數(shù)量變化實驗的改進措施

普通高中《生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)》選擇性必修課程模塊2《生物與環(huán)境》“探究培養(yǎng)液中某種酵母種群數(shù)量的動態(tài)變化”實驗有助于學(xué)生達成概念2的理解，促進學(xué)生生物學(xué)科核心素養(yǎng)的提升，并能夠運用數(shù)學(xué)模型表征種群數(shù)量變量的規(guī)律。[2]但課本中該實驗采用血球計數(shù)板計數(shù)，血球計數(shù)板需要使用上下兩個計數(shù)室，計數(shù)時間比較長且精確度較低，學(xué)生操作難度及誤差較大。本實驗改進為使用分光光度計測定菌液濃度，每次取樣后均置于4℃冰箱，待實驗結(jié)束后統(tǒng)一測定，每個樣品測定3次取均值，便于學(xué)生操作且減小實驗誤差。為縮短實驗時間采用豆芽汁低葡萄糖培養(yǎng)基，低葡萄糖濃度能夠加快酵母生長曲線不同時期的轉(zhuǎn)變，并且采用200rpm，30℃恒溫培養(yǎng)條件，加快菌體生長速度，使實驗在2天內(nèi)基本完成以適應(yīng)高中實驗課進度。為使菌株的生長延遲期易于觀察，采用萬分之一的接種量以避免迅速進入對數(shù)期。通過設(shè)計并進行預(yù)實驗確定合適的菌液接種時間，取樣時間及間隔，鍛煉學(xué)生的思考探究能力，通過觀察預(yù)實驗結(jié)果判斷生長速度及取樣方式，以減少實驗失敗幾率。

本實驗利用學(xué)生自制的傳統(tǒng)發(fā)酵食品果酒中篩選得到的酵母菌菌株，并進行18S rDNA測序分析，豐富了實驗過程與內(nèi)容，鍛煉了學(xué)生的實驗操作能力及解決困難的能力，并使其對酵母的來源及生理特性有了較全面的認識與了解。在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，進行液體培養(yǎng)并測定菌體濃度的變化，繪制酵母菌的生長曲線。在學(xué)生理解理想條件下種群的“J型”生長模型的基礎(chǔ)上，進一步討論在有限制的現(xiàn)實條件下種群的生長情況，并對得到的生長曲線劃分生長階段，從而更好地理解“S型”生長曲線各階段的特征及產(chǎn)生原因。[3]實驗過程中涉及微生物的液體培養(yǎng)、基因組提取、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、菌液的稀釋及濃度測定、生長曲線的繪制及分析等內(nèi)容，是涵蓋多方面課程知識的綜合實驗，能夠提升學(xué)生實驗?zāi)芰胺治鎏骄磕芰?，具有較高的可操作性和實踐性。

2 實驗的開展方法

2.1 實驗材料與儀器

2.1.1 菌種

2.1.2 試劑與材料

自制果酒，黃豆芽，葡萄糖，去離子水，無水乙醇，瓊脂粉等。

2.1.3 儀器設(shè)備

儀器：錐形瓶，比色皿，移液器，試管等；

設(shè)備：722型分光光度計，4℃冰箱，恒溫培養(yǎng)搖床，電泳儀，基因擴增儀、高壓滅菌鍋，電子天平等。

2.2 研究方法

2.2.1 培養(yǎng)基的配制

配制豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基：在100mL去離子水加入10g黃豆芽煮沸30min，用紗布過濾，補足損失水量后制得10%豆芽汁。取10%豆芽汁100mL，加入3g葡萄糖，搖勻，分裝到500mL錐形瓶中制得液體培養(yǎng)基，每組配制16瓶；另取液體培養(yǎng)基，再加入2g瓊脂混勻制得固體培養(yǎng)基，每組配制4瓶。實驗設(shè)置3組平行。將培養(yǎng)基，去離子水等實驗物品在121℃下高壓滅菌20min，冷卻至室溫。

作為中國農(nóng)資流通第一股，安徽輝隆集團的展位上，重點展示了以高效功能化的水溶肥系列、中微量元素復(fù)合肥系列、作物專用復(fù)合肥系列為代表的綠色生態(tài)肥，產(chǎn)品的科技含量和肥料利用率均創(chuàng)新高。無獨有偶，在參展產(chǎn)品中，“六國網(wǎng)”控失肥是六國化工與中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院合力打造的環(huán)保高效新型肥料，在提高肥料利用率、降低農(nóng)業(yè)污染方面取得了突破性成果，并延伸出多種作物專用肥及“六國網(wǎng)+全程營養(yǎng)解決方案”，同樣以科技含量高而吸引了眾多參觀者圍觀咨詢。

2.2.2 菌株的分離與純化

在超凈工作臺中取1mL果酒樣品加入到9mL的無菌去離子水中，混合均勻，取1mL稀釋液到9mL無菌去離子水中混合，重復(fù)此步驟，得到10-1到10-6的稀釋液。選擇10-4、10-5、10-6三個稀釋梯度，分別吸取100uL稀釋液加入無菌固體培養(yǎng)基表面，用無菌涂布棒在培養(yǎng)基表面涂布使菌液均勻鋪開。在30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)至有明顯菌落長出，依據(jù)酵母菌菌落形態(tài)特征初篩，挑取優(yōu)勢菌的單菌落至液體培養(yǎng)基中，在30℃，200rpm條件下振蕩培養(yǎng)至菌液渾濁，再次在固體培養(yǎng)基平板上涂板，重復(fù)步驟直至平板上為單一菌落。

2.2.3 酵母菌基因組DNA的提取與鑒定

將純化單菌挑至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得菌液，按照酵母菌基因組提取試劑盒（上海生工B518257）說明進行基因組DNA提取，以提取物作為模板進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（poLymerase chain reaction，PCR）擴增，引物為ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性反應(yīng)4min；94℃變性反應(yīng)30s，54℃退火反應(yīng)30s，72℃延伸反應(yīng)45s，循環(huán)30次；最后在72℃下延伸反應(yīng)10min得到擴增后DNA樣本，對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并送到上海生工測序。在NCBI網(wǎng)站中將所測序列進行BLAST分析，獲得菌株信息。

2.2.4 接種

在超凈工作臺中，向3組13個裝有100mL的滅菌培養(yǎng)基中分別加入1mL酵母菌菌懸液，輕輕振蕩混勻，并每組設(shè)置1個不加菌液的空白培養(yǎng)基作為對照。將錐形瓶編號并置于恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)。

2.2.5 取樣

在培養(yǎng)0、3、6、9、12、15、18、24、27、30、33、36、39、42、48h后分別取樣，即每隔3小時各組均取出一瓶樣品置于4℃冰箱中，做好標(biāo)記。

2.2.6 OD值的測定

在取樣結(jié)束后，取3組16支干凈試管，將不同培養(yǎng)時長的菌液及空白對照組培養(yǎng)基搖勻并各取5mL到試管中，編寫序號，將菌液進行適當(dāng)稀釋，使光密度處于0.1～0.65之間，以未接種的空白對照組液體培養(yǎng)基調(diào)零點，在680nm波長處，1cm比色皿中依次測定OD值。測定從濃度最低的菌懸液開始依次測定，測定兩個樣品間需要用去離子水多次沖洗比色皿。經(jīng)稀釋后的菌液OD值需要乘以稀釋倍數(shù)以得到實際OD值。

2.2.7 生長曲線的繪制

記錄測量得到的實際OD值數(shù)據(jù)，計算3組平行實驗的平均值，制成曲線圖并進行分析。

3 實驗結(jié)果與討論

菌株18S rDNA的測序結(jié)果為：AAACTCGGAAGGATCATTAAAGAAATTTAATAATTTTGAAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGAAAAA…經(jīng)過序列比對得到所篩菌株為釀酒酵母。

對3組平行實驗菌液的OD值取平均值，繪制得到如圖1所示的生長曲線圖。可以看出酵母菌菌體濃度呈現(xiàn)先升高后緩慢下降的趨勢，基本符合經(jīng)典“S型”生長曲線中各階段的特征。[4]0-6h左右菌體生長緩慢，濃度幾乎沒有增加，為生長延遲期，即酵母菌接種到新的培養(yǎng)基后，其代謝系統(tǒng)需要適應(yīng)新的環(huán)境，同時需要合成酶、輔酶、其他代謝中間代謝產(chǎn)物等，所以此時期的細胞數(shù)目基本沒有增加；6-30h左右為對數(shù)生長期，此階段適應(yīng)了新環(huán)境的酵母菌生長速率最快、代謝旺盛、酶系活躍、菌液濃度快速增加，同時外界環(huán)境也是最佳狀態(tài)；30-33h為穩(wěn)定期，酵母菌經(jīng)對數(shù)生長的大量繁殖，消耗了培養(yǎng)基的大量營養(yǎng)及氧氣，所產(chǎn)生的大量代謝產(chǎn)物使得酵母的繁殖受到抑制，并開始出現(xiàn)衰老死亡，死亡數(shù)量與增殖的酵母數(shù)基本持平，此時達到酵母菌生物量的峰值。33h以后菌液濃度開始下降，此階段為衰亡期，經(jīng)過前面的不斷消耗，使得培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)越來越少，酵母菌的繁殖得不到充分的營養(yǎng)，同時外界環(huán)境對繼續(xù)生長越來越不利，大量代謝產(chǎn)物的抑制，細胞的分解代謝大于合成代謝，導(dǎo)致此階段酵母死亡數(shù)量高于增殖數(shù)量，酵母總數(shù)不斷減少，整個群體出現(xiàn)負增長。

圖1 釀酒酵母生長曲線

在一定體積的液體培養(yǎng)基中，接種后的少量酵母迅速形成一個酵母種群，由于養(yǎng)分、空間、溫度和有毒排泄物等的影響，使酵母種群的數(shù)量有著類似于自然界中資源和空間有限的其他生物種群的增長規(guī)律，能夠一定程度上模擬自然條件下微生物的生產(chǎn)規(guī)律。[5]由于微生物的生長受到多方面因素的影響，培養(yǎng)基中糖的種類和濃度均對酵母的生長有影響，因此在指定培養(yǎng)基中酵母的生長曲線具有一定的特殊性，僅能代表一定培養(yǎng)條件下酵母的生長特性。[6]實驗中3個平行組的平均值得到的生長曲線基本符合“S型”曲線特征，能夠清晰地看出各時間段釀酒酵母在液體培養(yǎng)基中的群落動態(tài)變化，達到了實驗的預(yù)期目標(biāo)。

4 總結(jié)

本實驗對高中課程要求試驗進行了豐富和改進，更加符合目前高中生的能力水平與教學(xué)要求，并且提高了實驗的準(zhǔn)確性和可操作性，符合高中課程的時間安排與實際需求。改進后的實驗作為果酒制作以及酵母篩選培養(yǎng)的后續(xù)實驗，能夠從多方面鍛煉學(xué)生的時間安排能力與問題解決能力，使其認識到科學(xué)研究不僅需要嚴謹細致的腦力勞動，而且需要艱辛刻苦的體力付出，并利于學(xué)生理解微生物的生長特性同時培養(yǎng)學(xué)生探究分析能力和實驗操作技能。