張靚睿，王詩琪，王紅昀，董若瑤，孟勝男

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，沈陽 110122）

近年來，肝病的發(fā)病率逐年增高，肝損傷已經(jīng)成為臨床上威脅人類健康的常見殺手之一。造成肝損傷的原因主要有藥物性肝損傷、酒精性肝損傷和化學(xué)性肝損傷［1］。慢性肝損傷病程長，過程反復(fù)，可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌［2］，因此，慢性肝損傷的病因機(jī)制亟待研究。肝臟受損實(shí)質(zhì)是肝細(xì)胞損傷，肝細(xì)胞內(nèi)有多種細(xì)胞器，其中線粒體是肝臟中物質(zhì)代謝和能量代謝的中心［3］，與肝臟的代謝功能相輔相成。研究［4］發(fā)現(xiàn)，大鼠肝纖維化模型中觀察到肝細(xì)胞線粒體腫脹變形，結(jié)構(gòu)模糊，嵴減少、扭曲。肝細(xì)胞壞死在很大程度上還涉及細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑的激活。然而，在壞死細(xì)胞裂解期間細(xì)胞內(nèi)組分的釋放導(dǎo)致離子失衡，線粒體功能障礙，三磷酸腺苷 （adenosine triphosphate，ATP） 消耗并引發(fā)炎癥反應(yīng)［5］。本研究通過成功建立四氯化碳誘導(dǎo)大鼠慢性肝損傷模型，從線粒體功能、形態(tài)、電子傳遞等方面闡述了線粒體與肝損傷疾病的緊密聯(lián)系，為臨床探究慢性肝損傷疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號SCXK［京］2011-0011。

1.2 藥品與試劑

50%四氯化碳大豆油溶液：四氯化碳 （分析純）購自北京化學(xué)試劑有限公司，大豆油購自山東魯花集團(tuán)有限公司。線粒體提取試劑盒 （批號SM0020），線粒體膜電位檢測試劑盒 （JC-10） （批號CA1310） 均購自北京索萊寶科技有限公司，ATP檢測試劑盒 （批號S0026） 購自碧云天生物技術(shù)研究所，輔酶ⅠNAD（H） 試劑盒 （批號A114-1-1） 購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

DY89-9電動(dòng)玻璃勻漿器 （寧波新芝生物科技有限公司），3k15高速冷凍離心機(jī) （德國Sigma公司），BioSpectrometer紫外分光光度計(jì) （德國艾本德Eppendorf公司），imark酶標(biāo)儀 （美國Bio-Rad公司），SynergyTMHT多功能酶標(biāo)儀 （LB-940，美國Bio-tek公司），C2激光共聚焦顯微鏡 （日本尼康公司），超低溫冰箱 （美國Thermo Fisher公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模、分組：選取雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～200 g，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對照組和四氯化碳慢性肝損傷模型組2組，每組20只。四氯化碳慢性肝損傷模型組大鼠皮下注射50%四氯化碳大豆油溶液，每次給予0.2 mL/100 g，每周2次，連續(xù)10周。于造模第4周，第6周，第8周，第10周末次給藥后，各組隨機(jī)選取5只大鼠，禁食不禁水20 h，給予10%水合氯醛，按0.3 mL/kg腹腔注射麻醉，分離大鼠肝臟組織，選取肝臟大葉組織用于線粒體提取，其余置于-80 ℃ 保存待用。

1.4.2 大鼠肝臟組織線粒體提取與分離：應(yīng)用線粒體提取試劑盒分離大鼠肝臟組織胞質(zhì)與線粒體，按照試劑盒說明書操作。分離后得到的線粒體用于線粒體膜電位檢測與線粒體膜腫脹度檢測，具體提取分離方法為取200 mg肝組織，PBS沖洗后剪碎，放入玻璃勻漿器，加入1 mL Lysis Buffer，于冰浴研磨，將組織勻漿物4 ℃，1 000g，離心5 min，取上清，4 ℃，1 000g再次離心5 min。取上清，4 ℃，12 000g離心10 min，取上清，該上清含胞漿成分，置-80 ℃ 備用。向沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重懸線粒體，4 ℃，1 000g離心5 min。取上清，4 ℃，12 000g離心10 min，棄上清，加入50～100 μL Store Buffer重懸線粒體沉淀，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 肝組織線粒體膜電位檢測：按照線粒體膜電位檢測試劑盒 （JC-10） 說明書操作。取適量JC-10（200×） 染色液，按照每50 μL JC-10 （200×） 加入8 mL超純水的比例稀釋JC-10，充分溶解并混勻，再加入2 mL JC-10染色緩沖液 （5×），混勻，即為JC-10染色工作液。將工作液稀釋5倍，再加入0.1 mL總蛋白量為100 μg線粒體，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀測熒光。

1.4.4 肝組織線粒體膜腫脹度檢測［6］：配制反應(yīng)緩沖液 （蔗糖250 mmol/L，磷酸二氫鉀5 mmol/L，氯化鈣0.3 mmol/L，琥珀酸鈉3 mmol/L，pH7.4），調(diào)節(jié)線粒體濃度至0.5 mg/mL，應(yīng)用參比杯調(diào)零，于25 ℃ 在10 min內(nèi)連續(xù)測定520 nm處的吸光度值，以吸光度的下降值反應(yīng)線粒體的腫脹程度。

1.4.5 ATP含量檢測：采用ATP檢測試劑盒測定對照組與模型組肝臟ATP含量，按照說明書操作。每20 mg組織加入約200 μL裂解液，充分勻漿確保組織被完全裂解。裂解后4 ℃，12 000g離心5 min，取上清。配制ATP檢測工作液，采用ATP檢測工作液于多功能酶標(biāo)儀測定相對光單位（relative light unit，RLU）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肝臟組織中線粒體ATP濃度。

1.4.6 輔酶ⅠNAD （H） 含量檢測：按照輔酶ⅠNAD（H） 含量檢測試劑盒說明書操作。每100 mg組織加入1 mL酸/堿性提取液，冰浴研磨，煮沸5 min，冷卻后4 ℃，10 000g離心10 min，取上清液，加入等體積酸/堿性提取液使之中和，混勻，4 ℃，10 000g離心10 min，取上清。加入檢測試劑，混勻，應(yīng)用蒸餾水調(diào)零，于紫外分光光度計(jì)測定570 nm處吸光度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以表示，組間均數(shù)比較采用Student’st檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四氯化碳致大鼠慢性肝損傷對肝臟線粒體膜電位的影響

使用激光共聚焦顯微鏡分別觀察對照組與模型組線粒體膜電位水平，紅色熒光表示線粒體膜電位較高，提示線粒體膜電位正常，綠色熒光表示線粒體膜電位較低，提示線粒體膜電位受損，與對照組相比，模型組大鼠肝臟線粒體膜電位紅綠熒光比值顯著降低，且隨造模時(shí)間延長，紅色熒光強(qiáng)度呈下降趨勢，綠色熒光強(qiáng)度呈上升趨勢，紅綠熒光強(qiáng)度比值亦有所下降。可見紅綠色熒光比值具有時(shí)間依賴性。結(jié)果提示，模型組大鼠肝臟線粒體受損，且隨造模時(shí)間延長，肝臟線粒體受損程度增加。見圖1。

2.2 四氯化碳致大鼠慢性肝損傷對肝臟線粒體膜腫脹度的影響

如圖2所示，加入線粒體膜腫脹度檢測液后，在520 nm處各組吸光度值均下降，模型組吸光度值的下降幅度顯著低于對照組 （P< 0.01）。且隨造模時(shí)間的延長，模型組吸光度值下降幅度逐漸減弱。造模4周、6周后，模型組吸光度值有下降趨勢，但與對照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。造模8周、10周后，模型組吸光度值與對照組相比，下降幅度減弱，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P< 0.05），結(jié)果提示，模型組大鼠肝臟線粒體膜敏感性降低，造成線粒體損傷。

圖1 線粒體膜電位熒光圖Fig.1 Mitochondrial membrane potential fluorescence

圖2 線粒體腫脹程度Fig.2 Degree of mitochondrial swelling

2.3 四氯化碳致大鼠慢性肝損傷對肝臟線粒體ATP合成的影響

在四氯化碳致大鼠慢性肝損傷制備4周、6周、8周、10周后，模型組ATP含量分別為 （6.08±0.53）nmol/L，（3.97±1.04） nmol/L，（3.71±0.59） nmol/L，（4.39±0.75） nmol/L，對照組ATP含量分別為 （23.58±3.41） nmol/L，（26.78±3.06） nmol/L，（30.17±1.41）nmol/L，（26.75±3.45） nmol/L，比較2組ATP含量差異發(fā)現(xiàn)模型組ATP水平顯著低于對照組 （P< 0.001），且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P< 0.001）。結(jié)果提示，四氯化碳致大鼠慢性肝損傷導(dǎo)致線粒體ATP合成受損，表示線粒體功能損傷。

2.4 四氯化碳致大鼠慢性肝損傷對肝臟線粒體NADH/NAD+比值的影響

NADH/NAD+比值代表肝細(xì)胞線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)的功能，比值升高，提示三羧酸循環(huán)受損，表明肝細(xì)胞線粒體損傷。造模4周后，模型組與對照組NADH/NAD+比值分別為0.58±0.06與0.41±0.06，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模6周、8周、10周后，模型組與對照組NADH/NAD+比值分別為1.86±0.22，3.86±0.17，5.27±0.27與0.38±0.09，0.78±0.06，0.49±0.06，相比于對照組，模型組線粒體NADH/NAD+比值均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.001）。結(jié)果提示，四氯化碳致大鼠慢性肝損傷模型組肝細(xì)胞線粒體三羧酸循環(huán)受損，肝細(xì)胞線粒體功能障礙。

3 討論

肝臟是人體中的重要器官，在物質(zhì)代謝，解毒和排泄中起決定性作用［7］。四氯化碳誘導(dǎo)慢性肝損傷作為經(jīng)典模型，已被廣泛應(yīng)用［8］，該模型涉及四氯化碳可經(jīng)肝臟細(xì)胞色素酶代謝產(chǎn)生自由基［9］，共價(jià)結(jié)合細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜的大分子，使細(xì)胞內(nèi)酶功能喪失，線粒體損傷及細(xì)胞凋亡［10］。在本研究中，應(yīng)用此經(jīng)典模型探討肝臟疾病與線粒體功能障礙的關(guān)聯(lián)及其所致影響。

線粒體是生物體能量中心，是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的重要場所［11］。其參與真核生物的氧化代謝，能量轉(zhuǎn)化，三羧酸循壞，氧化磷酸化，主導(dǎo)合成ATP。主要功能包括調(diào)節(jié)細(xì)胞膜電位，控制細(xì)胞程序性死亡，調(diào)控細(xì)胞增殖與代謝［12］。大量研究［13-15］表明，線粒體膜電位水平是評判線粒體生物功能的標(biāo)志物，線粒體膜電位水平下降，提示線粒體生物功能障礙［15］。本研究應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體膜電位水平，發(fā)現(xiàn)模型組線粒體膜電位水平顯著低于對照組，表明模型組線粒體膜電位受損，提示四氯化碳誘導(dǎo)慢性肝損傷時(shí)，線粒體功能下降及活性降低，與研究［16］結(jié)果一致。本研究通過高鈣濃度引發(fā)線粒體腫脹，當(dāng)線粒體膜受損時(shí)，它對高鈣敏感度降低，表現(xiàn)為吸光度下降幅度減?。?］。本研究結(jié)果表明，模型組吸光度下降幅度較對照組有所減小，且隨造模時(shí)間延長，吸光度下降幅度差異增加，提示隨肝損傷程度增加，線粒體膜受損程度增加。有研究［17］表明當(dāng)線粒體膜電位紊亂時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP合成受損，氧化磷酸化水平降低。本研究發(fā)現(xiàn)，肝損傷模型組ATP水平顯著低于對照組，表明模型組肝臟線粒體產(chǎn)生ATP減少，提示慢性肝損傷模型下，ATP合成受損，能量代謝受損，可致線粒體氧化應(yīng)激發(fā)生，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放與激活［18］。輔酶ⅠNAD （H） 廣泛存在于生物體內(nèi)，主要參與生物體內(nèi)線粒體呼吸鏈電子傳遞［19］。NAD （H） 含量及NADH/NAD+比值的高低可用于評價(jià)線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)功能的強(qiáng)弱，較高的NAD （H） 及NADH/NAD+比值表明細(xì)胞呼吸鏈電子傳遞被抑制，損害線粒體功能［16］。本研究結(jié)果顯示，慢性肝損傷模型組NADH/NAD+比值顯著高于對照組，且隨造模時(shí)間延長，NADH/NAD+比值顯著提高，提示線粒體呼吸鏈功能受損，延長造模時(shí)間，則線粒體呼吸鏈損傷程度加重。

綜上所述，四氯化碳誘導(dǎo)大鼠慢性肝損傷模型中，線粒體生物功能受損，膜穩(wěn)定性降低，能量代謝及氧化磷酸化被抑制，表明線粒體損傷是四氯化碳引起慢性肝損傷的必要環(huán)節(jié)。線粒體損傷致肝臟能量代謝異常，表明肝損傷疾病與能量代謝密切相關(guān)，因此，研究線粒體生物功能及能量代謝情況在研究肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。