王麗娜 韋媛媛 胡華青 張曉雨 鄭美娟 費廣鶴

肺結(jié)節(jié)是指影像學表現(xiàn)為肺周圍孤立或多發(fā)的直徑≤3 cm，局灶性、類圓形的實性或亞實性密度增高影，不伴有肺不張、肺門淋巴結(jié)腫大和胸腔積液[1]。由于人口老齡化、環(huán)境變化和空氣污染等原因，肺結(jié)節(jié)的發(fā)病率日益增高，且得益于胸部低劑量計算機斷層掃描（low-dose computed tomography, LDCT）的普及[2]以及大眾對健康體檢的意識逐漸提高，越來越多的肺結(jié)節(jié)被發(fā)現(xiàn)。雖然大多數(shù)肺結(jié)節(jié)是良性的，但近半數(shù)的肺結(jié)節(jié)患者由于缺乏對疾病的正確認識，產(chǎn)生焦慮、抑郁等不良情緒變化[3]。來源于生理和心理上的壓力能激活包括輔助性T細胞17（T helper cell 17, Th17）、調(diào)節(jié)T細胞（regulatory Tcells, Tregs）在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫細胞，誘導促炎細胞因子的釋放，從而導致神經(jīng)遞質(zhì)改變和行為改變，并且這種現(xiàn)象在成年女性中表現(xiàn)的更為顯著[4-6]。Th17細胞和Tregs源自共同的幼稚T細胞前體，Th17細胞是在轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）和白細胞介素（interleukin, IL）-6等細胞因子協(xié)同作用下產(chǎn)生的介導炎癥反應(yīng)的免疫細胞，Tregs是由CD4+T淋巴細胞在TGF-β等細胞因子協(xié)同作用誘導下產(chǎn)生的，能夠抑制機體過強的免疫反應(yīng)的一種重要的免疫細胞。正常情況下，Th17細胞和Tregs保持動態(tài)平衡，二者失衡將會導致異常的免疫應(yīng)答[7]。目前的研究主要是采用影像學方法對肺結(jié)節(jié)進行早期診斷和良惡性的判別，而患者的不良情緒以及可能由此導致的不良生理及臨床后果并未引起足夠重視。本研究評估了肺結(jié)節(jié)患者的焦慮和抑郁狀態(tài)，檢測外周血Th17細胞、Tregs百分比及炎癥因子等，并探討其相互關(guān)系及臨床價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2019年4月-2019年7月于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院門診就診的肺結(jié)節(jié)患者103例；納入同期本院體檢中心健康體檢者40例組成健康對照（healthy control, HC）組。HC組入組標準：①貝克焦慮量表（Beck Anxiety Inventory, BAI）＜10分且貝克抑郁量表第二版（Beck Depression Inventory-II, BDI-II）＜14分；②胸部LDCT明確無肺結(jié)節(jié)及其他肺部疾病；③無精神、神經(jīng)、免疫系統(tǒng)及其他慢性疾病病史；④體檢未發(fā)現(xiàn)其他系統(tǒng)疾?。虎?周內(nèi)未服用任何藥物。肺結(jié)節(jié)組納入標準：①經(jīng)胸部LDCT發(fā)現(xiàn)肺結(jié)節(jié)時間≤3個月的首次正規(guī)就診患者；②一般情況良好，能夠完善相關(guān)檢查及心理測評；③年齡≥18歲。排除標準：①彌漫性肺結(jié)節(jié)（肺結(jié)節(jié)數(shù)量＞10個）；②隨訪6個月，排除肺結(jié)節(jié)明顯變化疑有惡變可能，或行手術(shù)治療后病理結(jié)果為惡性者；③合并精神、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病及其他慢性疾??；④合并惡性腫瘤；⑤2周內(nèi)發(fā)生過感染；⑥2周內(nèi)使用過抗炎、抗過敏、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學生物醫(yī)學倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 實驗室器材和試劑 美國BD公司FACSCanto Plus流式細胞儀；BD Bioscience公司FITC CD4、PE CD25、APC FoxP3、PE IL-17A、PE IgG1單克隆抗體、人細胞因子檢測試劑盒；eBioscience公司穿膜液、固定液。

1.3 情緒狀態(tài)評估 所有研究對象均采用BAI、BDI-II量表進行情緒狀態(tài)測評（肺結(jié)節(jié)患者在我院首次就診時進行）。BAI＜10分為無焦慮，10分-18分為輕-中度焦慮、19分-29分為中-重度焦慮、30分-63分為重度焦慮；BDI-II評分＜14分為無抑郁，14分-19分為輕度抑郁，20分-28分為中度抑郁，29分-63分為重度抑郁[8,9]。據(jù)此將103例肺結(jié)節(jié)患者分為無焦慮抑郁（non-anxiety and non-depression, NAD）組、焦慮和（或）抑郁（anxiety and depression, AD）組。

1.4 標本采集 所有受試者在進行情緒評估的當天上午9時-11時采集空腹靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，用于血常規(guī)及流式細胞術(shù)檢測；采集靜脈血5 mL于促凝管采集中，3,500 rpm離心5 min后，取血清保存于-80oC冰箱備用。

1.5 流式細胞術(shù)檢測Th17、Treg細胞 抗凝血與磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）1:1稀釋混勻，取淋巴細胞分離液置于離心管中，傾斜管體沿管壁緩慢加入稀釋血液。20oC以800g離心30 min，吸出中間白膜層即外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）置于流式管，PBS洗滌、稀釋、渦旋混勻后，均分于2支流式管，分別標注Tregs及Th17，另外隨機留取一份PBMC作為Th17細胞對照。Tregs管加入CD4、CD25單抗孵育、固定、穿膜后加入FoxP3單抗孵育，洗滌、PBS混勻上機檢測。Th17管及對照管分別加入由DMEM、小牛血清、離子霉素、莫能菌素、豆蔻酰佛波醇乙酯、青鏈霉素雙抗配制的培養(yǎng)基，置于37oC溫箱孵育5 h。后加入CD4單抗孵育、固定、穿膜。Th17管加入IL-17A單抗、對照管加入IgG1單抗孵育，洗滌、PBS混勻上機檢測。采用FlowJo V10.0.1軟件進行數(shù)據(jù)分析。利用血常規(guī)中淋巴細胞絕對數(shù)計算Th17細胞絕對數(shù)。

1.6 多重液相蛋白定量技術(shù)（cytometric bead array, CBA）檢測炎癥因子 按照CBA試劑盒說明書制備細胞因子標準品，利用標準品梯度稀釋以配制標準曲線；分別取IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）捕獲磁珠混勻，離心去上清后加入血清刺激液避光孵育。標椎曲線中加入混合磁珠、抗體，待測標本中加入混合磁珠、血清、抗體，混勻避光孵育3 h，洗滌后加入PBS上機檢測。采用BD FACSDiva V6.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，不符合正態(tài)分布的資料采用中位數(shù)（M）和四分位數(shù)間距（interquartile range, IQR）表示，各組間年齡、體重指數(shù)（body mass index, BMI）、免疫細胞、炎癥因子的比較采用單因素方差分析；各組間性別構(gòu)成、吸煙人數(shù)以及性別對患者焦慮抑郁狀態(tài)的影響采用χ2檢驗；各組間受教育年限、BAI總分、BDI-II總分的比較采用Kruskal-Walls H檢驗；AD組中免疫細胞、炎癥因子與焦慮、抑郁程度采用Spearman秩相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 根據(jù)入組和排除標準，共143例受試者納入本研究，HC組40例，NAD組62例、AD組41例，各組間年齡、性別、吸煙人數(shù)、BMI、受教育年限差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 不同性別肺結(jié)節(jié)患者焦慮/抑郁比較 女性肺結(jié)節(jié)患者47例，其中無焦慮抑郁23例，焦慮和（或）抑郁24例；男性肺結(jié)節(jié)患者56例，其中無焦慮抑郁39例，焦慮和（或）抑郁17例，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.573,P=0.032）。

2.3 組間Th17細胞百分比、Th17細胞絕對數(shù)、Th17/Treg、IL-2、IL-6、TNF-α水平比較 Th17細胞百分比、Th17細胞絕對數(shù)、Th17/Treg、IL-2、IL-6、TNF-α水平在HC組、NAD組、AD組間的差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001），AD組要高于HC組和NAD組；HC組和NAD組間的差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。Tregs百分比、IL-4、IL-10水平在各組間差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（表2，圖1）。

2.4 焦慮/抑郁相關(guān)因素分析 AD組中無焦慮5例，輕-中度焦慮31例，中-重度焦慮4例，重度焦慮1例；患者焦慮程度與Th17細胞百分比（rs=-0.271）、Th17細胞絕對數(shù)（rs=-0.189）、Th17/Treg（rs=-0.024）、IL-2（rs=-0.284）、IL-6（rs=-0.068）、TNF-α（rs=-0.036）水平無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。無抑郁23例，輕度抑郁14例，中度抑郁2例，重度抑郁2例；患者抑郁程度與Th17細胞百分比（rs=0.131）、Th17細胞絕對數(shù)（rs=0.247）、Th17/Treg（rs=-0.039）、IL-2（rs=-0.014）、IL-6（rs=0.051）、TNF-α（rs=-0.097）水平無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

近年來，人們健康意識日益增強，由LDCT篩查出的肺結(jié)節(jié)越來越多，這雖然提高了早期肺癌的診斷率，但同時也給一些患者帶來了嚴重的心理負擔，導致反復多處就診等過度醫(yī)療行為。世界衛(wèi)生組織關(guān)于精神疾病的調(diào)查結(jié)果顯示我國成年人焦慮障礙和抑郁障礙的患病率分別為4.8%和3.6%，這一比例在本研究的肺結(jié)節(jié)患者中分別為35%和17%[10]，明顯高于大眾人群焦慮、抑郁障礙的患病率，說明肺結(jié)節(jié)的確會使許多患者產(chǎn)生精神壓力。此外，在本研究的實際調(diào)查中還發(fā)現(xiàn)處于焦慮抑郁狀態(tài)的肺結(jié)節(jié)患者不僅有緊張、恐懼、情緒低落等情感變化，在發(fā)現(xiàn)肺結(jié)節(jié)后還會出現(xiàn)胸悶、胸痛、頭暈等與肺結(jié)節(jié)無關(guān)的癥狀，甚至出現(xiàn)食欲、睡眠、性欲等的改變，這極大地影響了患者的日常生活。已有研究[5]觀察到焦慮和抑郁障礙的患者存在免疫細胞亞群的失衡和促炎細胞因子水平的升高，但在出現(xiàn)焦慮、抑郁的肺結(jié)節(jié)患者中是否也存在這一現(xiàn)象仍不得而知。

表1 各組受試者的一般臨床資料Tab 1 General clinical data of subjects in each group

表2 各組受試者免疫細胞和炎癥因子的統(tǒng)計學結(jié)果（Mean±SD）Tab 2 Statistical results of immune cells and inflammatory factors of subjects in each group (Mean±SD)

BAI是一種簡便易行的焦慮測評量表，與其他常用的量表如漢密爾頓焦慮量表、狀態(tài)-特質(zhì)焦慮問卷相比，同樣有著良好的效度[11]。BAI的特點是能夠排除抑郁的干擾而獲得較準確的焦慮評分，因此已被廣泛地用于多種疾病狀態(tài)下的心理評估。不僅如此，BAI還具有時間敏感性，尤其適用于對肺結(jié)節(jié)患者焦慮狀態(tài)的長期隨訪下的評價[12]。BDI-II在區(qū)分抑郁和非抑郁受試者上有著極高的可靠性，是衡量抑郁癥嚴重程度的一種經(jīng)濟有效的量表，目前已使用超過22年，被翻譯成近20種語言，在全球逾7,000項的研究和臨床實踐中被廣泛使用[13]。因此本研究選擇BAI和BDI-II來評估肺結(jié)節(jié)患者是否處于焦慮、抑郁的狀態(tài)，并且通過流式細胞和CBA技術(shù)來檢測受試者的免疫細胞及炎癥因子水平，進而探討患者是否因情緒的變化導致機體出現(xiàn)免疫失調(diào)及炎癥因子水平的改變。

由于血清免疫細胞、炎癥因子易受多種因素的影響，尤其是Th17與Treg在肺癌的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用[14]，因此排除肺癌患者對提高本研究的準確性至關(guān)重要。顯然，對全部肺結(jié)節(jié)患者都進行病理學檢查以明確性質(zhì)并不現(xiàn)實，所以本研究通過對患者進行連續(xù)6個月的隨訪盡可能地排除肺癌。此外，本研究還排除了神經(jīng)精神疾病、感染、腫瘤和心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病及服用各種藥物的情況。

圖1 三組間Th17細胞和Tregs百分比。相比于HC組及NAD組，AD組的Th17細胞百分明顯升高（P＜0.001），而HC組與NAD組之間無顯著差異（P=0.237）。Tregs百分比在三組間的差異無統(tǒng)計學意義（P=0.142）。Fig 1 The percentage of Th17 cells and Tregs among three groups. The percentage of Th17 cells in AD group was higher than the HC and NAD groups (P＜0.001), while there was no significant difference between HC group and NAD group (P=0.237). There were no statistically significant differences in the percentage of Tregs among three groups (P=0.142).

本研究發(fā)現(xiàn)，相比于HC組和NAD組，AD組患者的外周血Th17細胞百分比、Th17細胞絕對值、Th17/Treg及IL-2、IL-6、TNF-α水平顯著升高。Th17細胞百分比、Th17細胞絕對值、Th17/Treg的升高提示機體免疫功能出現(xiàn)失調(diào)，IL-2、IL-6、TNF-α水平的升高則提示機體存在異常的炎癥反應(yīng)。而上述指標在HC組及NAD組間差異無統(tǒng)計學意義，這說明免疫細胞及炎癥因子水平的改變與焦慮、抑郁障礙密切相關(guān)，而非肺結(jié)節(jié)本身所造成。Bekhbat等[5]的研究發(fā)現(xiàn)在經(jīng)歷幾小時到幾周的持續(xù)壓力作用下，機體生理上可能發(fā)生永久改變，進而干擾免疫系統(tǒng)的正常功能，導致炎癥或疾病狀態(tài)的發(fā)生。很多疾病都可能共患焦慮、抑郁，這些患者暴露于創(chuàng)傷和壓力下會導致下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA）軸的敏感性提高、機體免疫系統(tǒng)激活，并釋放促炎細胞因子[15]，隨著壓力暴露時間的延長，HAP和免疫系統(tǒng)相繼出現(xiàn)功能紊亂[16]，導致免疫功能失調(diào)以及異常炎癥反應(yīng)。這解釋了多種免疫細胞和炎癥因子在肺結(jié)節(jié)合并焦慮和抑郁的患者中異常升高的現(xiàn)象。然而情緒是十分復雜的高級認知活動，情緒障礙的時長、抑制炎癥通路的激活以及生活環(huán)境等因素的差異可能是導致本研究中焦慮組和抑郁組患者免疫細胞和炎癥因子水平的變化與焦慮、抑郁程度無相關(guān)性的原因。

雖然許多研究表明在精神障礙疾病中，促炎細胞因子（如IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-17等）水平顯著升高[17,18]，但抗炎因子水平的變化并不一致。Zou等[19]發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者抗炎細胞因子水平升高，而Wang等[20]卻發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙患者的抗炎因子水平正常。本研究中各組間IL-4、IL-10水平差異無統(tǒng)計學意義，這提示抗炎因子對精神障礙的作用機制暫不明確，且易受多種因素的影響。

Faravelli等[4]發(fā)現(xiàn)在同樣壓力下，女性患焦慮抑郁的概率是男性的1.8倍，而本研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)節(jié)患者中出現(xiàn)焦慮抑郁的男女比例為1:1.7，Slatore等[3]的研究表明39%的患者因偶然發(fā)現(xiàn)肺結(jié)節(jié)感到不同程度的心理壓力，在醫(yī)生與患者充分的溝通后可以減輕心理壓力所帶來的困擾。這提示在臨床工作中需要對肺結(jié)節(jié)患者尤其是女性患者的心理狀態(tài)予以更多的關(guān)注，指導科學治療。

肺結(jié)節(jié)患者出現(xiàn)情緒障礙，主要是由于缺乏對疾病的正確認識，將肺結(jié)節(jié)直接等同于肺癌。本研究證實這種情緒狀態(tài)會導致免疫功能失調(diào)和低級別炎癥。病理生理學研究[16]發(fā)現(xiàn)情緒障礙與機體炎癥、免疫功能失調(diào)間存在相互促進作用：免疫失調(diào)和炎癥會使患者產(chǎn)生焦慮、抑郁等情緒障礙，而情緒障礙會進一步加重這一過程的進展，因此如果不及時地對患者進行心理疏導，給予科學合理的治療建議，不僅會加重患者的情緒障礙，而且可能會影響到疾病的預后。早期發(fā)現(xiàn)并及時給予心理干預，調(diào)節(jié)患者的情緒狀態(tài)，將極大地改善患者的依從性，阻斷炎癥、免疫失調(diào)和不良情緒間的惡性循環(huán)，提高肺結(jié)節(jié)治療的規(guī)范性和有效率。

本研究的局限性在于病例數(shù)較少，且未能研究心理干預治療是否會對相關(guān)指標的好轉(zhuǎn)及肺結(jié)節(jié)的預后產(chǎn)生影響。此外，患者入組時均系近期發(fā)現(xiàn)的肺結(jié)節(jié)，因此暫未能獲得長期隨訪資料，而患者的心理狀態(tài)是會隨著時間不斷變化的。但本項研究還在繼續(xù)，入組的患者數(shù)量不斷增加，對患者的隨訪尤其是病理結(jié)果的跟蹤也在持續(xù)進行。相信通過對免疫細胞、炎癥指標和心理狀態(tài)的動態(tài)觀測，以及加入心理干預的治療研究，將會得到更有價值和深度的研究結(jié)果，從而更好地指導臨床治療。

Author contributions

Wang LN and Fei GH conceived and designed the study.Wang LN and Wei YY performed the experiments. Wang LN and Fei GH analyzed the date. Zheng MJ contributed analysis tools. Hu HQ and Zhang XY provided critical inputs on design,analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.