賈梓淇 梁乃新 李單青

在中國，2015年肺癌總發(fā)病人數(shù)約為733,300例，總死亡例數(shù)約為610,200例[1]，為發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤。盡管靶向治療和免疫治療相關(guān)的新藥研發(fā)提高了肺癌的總體生存期（overall survival, OS），但2012年-2015年中國的肺癌患者5年存活率仍僅為19.7%，其中農(nóng)村地區(qū)患者5年生存率僅為15.4%[2]，而預(yù)計(jì)肺癌仍會是未來十年死亡率最高的腫瘤之一。導(dǎo)致其預(yù)后不良的一個(gè)關(guān)鍵原因是新藥研發(fā)成功率低。與血液系統(tǒng)惡性腫瘤新藥研發(fā)的III期臨床試驗(yàn)成功率可以超過50%相比，肺癌該成功率僅為30%[3]。面對這一現(xiàn)狀，尋找適于肺癌新藥研究的臨床前模型顯得尤為重要。肺癌腫瘤類器官（patient-derived organoids, PDO）作為能夠濃縮原始腫瘤的多組學(xué)特征、模擬患者腫瘤藥敏特性的功能學(xué)模型在新藥研發(fā)過程中脫穎而出。本文將對PDO模型在肺癌精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用背景、現(xiàn)狀及前景作一綜述。

1 PDO概述

1.1 PDO定義 PDO是通過對腫瘤組織進(jìn)行三維培養(yǎng)得到的保留原始腫瘤多項(xiàng)特征的多細(xì)胞團(tuán)[4]。經(jīng)研究證實(shí)，結(jié)直腸癌[5,6]、子宮內(nèi)膜癌[6]、胰腺癌[7]、前列腺癌[8]、膀胱癌[9]、乳腺癌[10]、卵巢癌[11]、頭頸癌[12]以及最新研究的肺癌[13,14]等PDO在基因組、轉(zhuǎn)錄組以及免疫組化染色特點(diǎn)上濃縮了原始腫瘤的特征，即二者在多組學(xué)層面上重合度高，且基因組中未重合部分為臨床意義不明或不可靶向的基因[5]。在功能學(xué)方面，與原始腫瘤組織高度一致的藥敏特性使其成為癌癥新藥研發(fā)的熱點(diǎn)模型[7]，同時(shí)也成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方案中的潛在新策略。

1.2 類器官在指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥方面的優(yōu)勢 目前應(yīng)用于腫瘤研究的臨床前模型包括細(xì)胞系、二維腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)（two-dimensional cancer culture, 2D-CC）和小鼠移植瘤模型[15]。細(xì)胞系在腫瘤研究中應(yīng)用最早且最為廣泛，其優(yōu)勢在于可操縱、周期短、通量高[16]，利于構(gòu)建具有某種基因突變的腫瘤細(xì)胞模型，以研究基因-藥物敏感性關(guān)系。但同時(shí)，其劣勢在于由于其細(xì)胞成分單一，難以描述腫瘤的復(fù)雜性（包括瘤內(nèi)及瘤間異質(zhì)性）[17]，即難以反映不同患者腫瘤的個(gè)體化特征，無法用于指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥。2D-CC模型取材自患者腫瘤，可以保留原始腫瘤的異質(zhì)性，但難以經(jīng)歷多次傳代建庫，其中2D肺癌細(xì)胞模型（twodimensional lung cancer, 2D-LC）在經(jīng)過5次傳代后生長速率會明顯減慢，細(xì)胞開始衰老。小鼠移植瘤模型則能很好地保留原始腫瘤的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組成、分子生物學(xué)特征和原始腫瘤的復(fù)雜性[18]，并且最多可以經(jīng)過14次傳代后仍在組織學(xué)、基因組上保持穩(wěn)定[14]。但是移植瘤模型培養(yǎng)周期在2個(gè)月-10個(gè)月[18,19]，成功率平均在23%-90%[20]，不適于指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥和高通量藥物敏感性篩選。

相比之下，PDO具有以下優(yōu)勢：①PDO可以很好地代表并濃縮原始腫瘤的諸多形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)特征，且能部分模擬原始腫瘤的生理和藥敏特性[5-10,14,21,22]；②PDO易于構(gòu)建，目前可以通過腫瘤手術(shù)標(biāo)本、穿刺標(biāo)本及循環(huán)腫瘤細(xì)胞[23]建立PDO模型；③PDO的增殖速度較快、培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)成功率較高，應(yīng)用于臨床時(shí)藥敏結(jié)果回報(bào)周期短[24]；④PDO基因及生理特征穩(wěn)定性好，經(jīng)過多代培養(yǎng)仍保持穩(wěn)定[4]，可用于構(gòu)建PDO生物樣本庫[22,25,26]。從指導(dǎo)未來精準(zhǔn)治療藥物研發(fā)角度來講：①PDO可操作性好，實(shí)驗(yàn)室可以對PDO模型進(jìn)行基因編輯等操作[27]；②PDO可以進(jìn)行高通量藥敏篩查，可以提高藥物篩選效率[28]；③其包含多種細(xì)胞類型，可以在簡化環(huán)境下研究腫瘤微環(huán)境中某些細(xì)胞間相互作用和形態(tài)學(xué)發(fā)生過程[4,29,30]；④可用于構(gòu)建疾病發(fā)生模型[27]。相比之下，PDO是一種經(jīng)濟(jì)-時(shí)間費(fèi)效比低且未來應(yīng)用廣泛的臨床前模型。

1.3 肺癌類器官的成功培養(yǎng) 肺癌在不同個(gè)體間體現(xiàn)出的巨大異質(zhì)性體現(xiàn)在腫瘤的臨床特征、組織學(xué)特征、多組學(xué)檢測結(jié)果以及藥物敏感性上[17]，驅(qū)動著肺癌的治療走上個(gè)體化、精準(zhǔn)化路線。然而由于個(gè)體間基因檢測結(jié)果在豐度、驅(qū)動基因、伴隨基因等方面異質(zhì)性大，在現(xiàn)有體系下僅根據(jù)驅(qū)動基因選擇治療難以實(shí)現(xiàn)每例患者的真正精準(zhǔn)個(gè)體化。而如前所述肺癌PDO相較于其他臨床前模型臨床使用價(jià)值更高，故培養(yǎng)肺癌PDO勢在必行。肺癌有諸多組織學(xué)亞型，目前腺癌、鱗癌、腺鱗癌、大細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌均能被成功培養(yǎng)[13,31]。經(jīng)短期培養(yǎng)的肺癌類器官（shortterm lung cancer organoid, stLCO）指培養(yǎng)1個(gè)月-3個(gè)月獲得的肺癌類器官；經(jīng)長期培養(yǎng)得到的類器官（long-term organoid, ltLCO）指培養(yǎng)時(shí)間超過3個(gè)月的類器官，往往可以以不小于1:3的比例傳代超過10次，且不存在隨著傳代次數(shù)增加而傳代效率降低的現(xiàn)象[14]。ltLCO可以經(jīng)受長于1年的低溫儲存，并在凍存后可以成功復(fù)蘇。

成功培養(yǎng)出的肺癌PDO能夠在組織學(xué)結(jié)構(gòu)上與原始腫瘤保持一致，其中腺癌的諸多病理亞型，包括貼壁、腺泡、實(shí)性、乳頭和微乳頭等病理學(xué)特征也能夠在肺癌PDO中保持一致[14]。①遺傳學(xué)特征方面：ltLCO可以在多次傳代（＞10次）后仍保留原腫瘤的主要突變和基因拷貝數(shù)變異（copy number variations, CNV）[13,14]。肺癌PDO對藥物的敏感性也遵循“突變-藥物”關(guān)系[32]，如攜帶乳腺癌2號基因（breast cancer 2,BRCA2）突變的肺癌PDO對奧拉帕尼敏感，攜帶表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變的肺癌PDO對厄洛替尼敏感[13,14]，攜帶EGFR突變/肝細(xì)胞生長因子受體擴(kuò)增突變的肺癌PDO對克唑替尼敏感[13]；②新藥方面：攜帶人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）突變的肺癌PDO對新藥吡咯替尼敏感，患者用藥后也獲得了部分緩解（partial response, PR）[33]；③聯(lián)合用藥的藥敏試驗(yàn)方面：PDO的體外實(shí)驗(yàn)在1例患者中證明了MEK/PI3K抑制劑聯(lián)合成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor-1, FGFR1）抑制劑在FGFR1擴(kuò)增患者中可能有效，并在活體（in vivo）試驗(yàn)中得到了驗(yàn)證[14]。盡管stLCO培養(yǎng)時(shí)間較短，但已有足夠多的細(xì)胞可用于藥敏試驗(yàn)和生物標(biāo)志物的臨床前試驗(yàn)[14]。目前，肺癌PDO從離體培養(yǎng)到藥敏測試的平均培養(yǎng)周期是2周，細(xì)胞生存曲線往往在用藥處理后第6天繪制[13]。即：從離體到得到藥物敏感性結(jié)果的平均周期約3周。在時(shí)效性上，有用于臨床篩選藥物的潛力。

2 肺癌精準(zhǔn)治療策略

圖1 肺癌的精準(zhǔn)治療策略。T：靶向治療；I/O：免疫治療；2D-LC：2D肺癌細(xì)胞培養(yǎng)；PDX：小鼠移植瘤模型；PDO：類器官；PDO+：與其他組織類型干細(xì)胞共培養(yǎng)的類器官；PDO-X：利用PDO構(gòu)建的小鼠移植瘤模型。Fig 1 The precision medicine treatment strategy in lung cancer. T: Target therapy; I/O: Immunotherapy; 2D-LC: two-dimensional lung cancer cell culture; PDX: patient-derived xenograft; PDO: patient-derived organoid; PDO+: patient-derived organoid co-culture; PDO-X: xenografts that are derived from patient-derived organoids.

肺癌精準(zhǔn)治療的現(xiàn)狀：肺癌精準(zhǔn)治療即利用生物標(biāo)志物（biomarkers）將患者細(xì)分為不同亞型，以篩選出對某一治療敏感的人群，從而針對該人群精準(zhǔn)用藥。傳統(tǒng)的腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期僅是在腫瘤的進(jìn)展過程中捕捉了診斷這一瞬間的局部和遠(yuǎn)處侵犯程度，既無法用于回溯腫瘤的發(fā)生，也無法用于個(gè)體化預(yù)測腫瘤對某一治療的反應(yīng)。但TNM分期中的腫瘤大小、是否侵犯胸膜、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等作為生物標(biāo)志物，指導(dǎo)了我們對腫瘤預(yù)后的基本判斷以及是否選擇對患者進(jìn)行手術(shù)等局部治療等，是進(jìn)行一切治療的基礎(chǔ)。病理分類亦然，病理切片中不同免疫組化標(biāo)志物也作為生物標(biāo)志物，幫助臨床醫(yī)生進(jìn)一步將患者進(jìn)行分類。但隨著對腫瘤認(rèn)識的發(fā)展，越來越多的腫瘤標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，一部分標(biāo)志物直接作為新藥研發(fā)靶點(diǎn)，而另一部分則用于在新藥研發(fā)的臨床試驗(yàn)中對患者分層以尋找適用人群。據(jù)統(tǒng)計(jì)，至2019年，預(yù)測性生物標(biāo)志物參與了60%的腫瘤新藥研發(fā)，而使用生物標(biāo)志物對入組患者進(jìn)行分層分析的臨床試驗(yàn)占全部腫瘤臨床試驗(yàn)的39%，與2010年相比增長了25%，提示精準(zhǔn)治療在腫瘤治療中占據(jù)著越來越重要的地位?？偠灾?，精準(zhǔn)診斷意味著臨床醫(yī)生應(yīng)該把握兩條主線：一條是傳統(tǒng)診斷，包括：形態(tài)影像學(xué)、功能影像學(xué)、普通病理學(xué)和腫瘤標(biāo)志物等；另一條則是精準(zhǔn)診斷，包括：以中心法則為核心的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)表達(dá)，甚至表觀組學(xué)、微生物組學(xué)等。兩條主線并行，才能夠提供足夠的決策證據(jù)和預(yù)后信息（圖1）。其中，處于核心地位且證據(jù)等級較高的是通過基因檢測結(jié)果來選擇治療方案，如根據(jù)腫瘤的驅(qū)動基因選擇靶向治療方案、根據(jù)腫瘤的腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden, TMB）來指導(dǎo)是否選擇免疫治療等。

靶向治療方面，針對EGFR、c-ros原癌基因1（c-ros oncogene 1 receptor kinase,ROS1）和間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）的靶向藥物發(fā)展迅猛[34]，并已經(jīng)徹底改變了部分肺癌患者的治療方法。然而，靶向治療仍有很大局限：①大多數(shù)患者仍缺乏可治驅(qū)動基因突變，這部分人群目前可以接受化療、放療、免疫治療或聯(lián)合治療等，但是患者對何種藥物敏感、能否對跨適應(yīng)證的某藥物敏感，單從多組學(xué)檢測結(jié)果判斷效果欠佳；②除缺乏可治驅(qū)動突變的患者外，有可治驅(qū)動突變的患者接受一線治療后仍有可能出現(xiàn)進(jìn)展。造成腫瘤進(jìn)展的原因來自于兩方面，一是經(jīng)一線治療后腫瘤本身出現(xiàn)耐藥突變，二是腫瘤細(xì)胞通過產(chǎn)生可塑性逃逸靶向治療[34,35]。從腫瘤本身產(chǎn)生基因突變以繞過靶點(diǎn)這一耐藥機(jī)制來講，并非全部的新發(fā)基因突變都已有相應(yīng)新藥被研制上市。而從腫瘤改變可塑性以逃逸靶向治療這一機(jī)制來講，防止可塑性細(xì)胞產(chǎn)生、逆轉(zhuǎn)可塑性、殺傷轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的藥物也仍在研發(fā)進(jìn)程當(dāng)中[34]。此時(shí)，根據(jù)現(xiàn)有的“多組學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”和“基因-藥物關(guān)系”、針對新的激活旁路來選擇患者的二線用藥，在多數(shù)情況下頗顯困難；③不同患者的伴隨突變、胚系基因組的不同[17]，給腫瘤細(xì)胞提供了不同的基因背景，以現(xiàn)有的分子生物學(xué)研究水平，難以完全解讀全部患者腫瘤進(jìn)展的內(nèi)在原因并做到個(gè)體化；④相同突變基因的不同突變類型及突變位點(diǎn)可能導(dǎo)致患者對藥物的敏感性不同，如EGFRp.L858R突變與EGFR20外顯子插入突變對一代EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）敏感性不同，而對同一基因的不同突變類型的研究亦尚不完善；⑤基因的表達(dá)和修飾異常也可能對細(xì)胞生理學(xué)造成較大的影響，而關(guān)于轉(zhuǎn)錄組、表觀遺傳組學(xué)的研究仍待深入；⑥由于一個(gè)基因在分子信號網(wǎng)絡(luò)中往往位于多個(gè)通路的交點(diǎn)，其突變可能對腫瘤的多個(gè)信號通路造成影響，從而改變腫瘤的多項(xiàng)生物學(xué)特征；⑦對腫瘤的某一通路進(jìn)行抑制，往往會導(dǎo)致腫瘤通過其他通路激活、下游蛋白異常激活等方式而出現(xiàn)耐藥。這些局限成為肺癌治療中的難點(diǎn)和痛點(diǎn)。

3 肺癌類器官在精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用前景

利用PDO指導(dǎo)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是根據(jù)“黑箱理論”在藥物于腫瘤細(xì)胞內(nèi)具體發(fā)揮的分子層面機(jī)制未知的前提下，直接根據(jù)體外模型對藥物的敏感度預(yù)測該藥物針對患者體內(nèi)腫瘤的療效（圖1），因此，可以很好地克服單從基因來推測原腫瘤對藥物反應(yīng)中遇到的上述困難。其在臨床上與目前的基于中心法則的分子檢測互補(bǔ)，有廣闊的應(yīng)用前景。PDO在肺癌的應(yīng)用中顯得尤為重要。因?yàn)槟壳搬槍Ψ伟┯行У乃幬镙^其他癌種多，故在肺癌的耐藥機(jī)制的探究以及耐藥后二線用藥的選擇方面，PDO有很大的發(fā)揮空間。同時(shí)，肺癌的可治靶點(diǎn)相對較多，結(jié)合PDO可以在信號通路方面進(jìn)一步解讀肺癌耐藥性。另外，因?yàn)榉伟┑膩喰洼^多，盡管針對腺癌目前以多組學(xué)為基礎(chǔ)的精準(zhǔn)治療方案顯示出諸多優(yōu)勢，但是針對鱗癌、大細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌等研究仍需PDO助力[13,36]。同時(shí)，肺癌樣本的獲取方式豐富，無論是通過手術(shù)獲得的大樣本、穿刺樣本還是胸腔積液都已被用于成功建立器官樣培養(yǎng)物，并已驗(yàn)證其驅(qū)動突變和藥物療效與原始腫瘤的一致性[14,36]。

然而，只有經(jīng)過大規(guī)模臨床研究驗(yàn)證后，體外功能學(xué)模型的腫瘤藥敏檢測結(jié)果才能實(shí)際應(yīng)用于臨床。在血液惡性腫瘤中，體外功能學(xué)模型的培養(yǎng)和藥敏檢測應(yīng)用較為成熟，且已經(jīng)有相關(guān)急性粒細(xì)胞白血病注冊臨床試驗(yàn)開展（clinicaltrials.gov identifier NCT: NCT01620216）。實(shí)體瘤體外模型的建立相比血液腫瘤更困難，因?yàn)槠湔w培養(yǎng)效率低、培養(yǎng)速度慢等特點(diǎn)，實(shí)體瘤的體外模型在臨床應(yīng)用上晚于血液惡性腫瘤。實(shí)體瘤中，PDO在胃腸道腫瘤的研究領(lǐng)先于其他腫瘤。已有研究[28]驗(yàn)證在轉(zhuǎn)移性胃腸道腫瘤中PDO藥物篩選結(jié)果與腫瘤分子檢測提示的用藥選擇相符合，且在I期/II期臨床試驗(yàn)中與患者的治療反應(yīng)相匹配，陽性預(yù)測值為88%，陰性預(yù)測值為100%。另一項(xiàng)前瞻性觀察性研究[21]則證明在結(jié)直腸癌中PDO對不同的化療方案預(yù)測能力不同，暗示了大規(guī)模臨床研究的必要性。目前，只有兩項(xiàng)肺癌PDO的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，但均為單純的轉(zhuǎn)化性研究，研究對象均為IV期肺癌，研究目的分別是探究PDO對肺癌標(biāo)準(zhǔn)治療的預(yù)測準(zhǔn)確性和判斷PDO篩選出的末線治療手段臨床上是否有效（clinicaltrials.gov: TUMOROID,NL49002.031.14; SENSOR, NL50400.031.14）[37]。更多關(guān)于早期肺癌的驗(yàn)證還有待開展。

PDO的未來發(fā)展方向是PDO芯片，其用處之一是提高新藥篩選效率。目前光學(xué)代謝成像（optical metabolic imaging, OMI）的進(jìn)展為制作PDO藥敏芯片并提高篩選效率提供了可能。肺PDO目前能在96孔板[38]和384孔板[39]上進(jìn)行藥敏檢測，但肺癌PDO芯片仍待進(jìn)一步研究。

4 肺癌類器官在精準(zhǔn)治療應(yīng)用中面臨的問題

PDO與原始腫瘤一致性的探究仍待完善。需要回答的問題包括：癌癥PDO模型是否代表腫瘤絕大部分亞群的克隆，抑或PDO是肺癌干細(xì)胞群的某一子集的擴(kuò)增；PDO沒有覆蓋的原始腫瘤突變是否有明確的臨床價(jià)值；PDO和原始腫瘤在除基因組外的其他組學(xué)研究上是否一致?；卮疬@一問題，需要較大規(guī)模的原始腫瘤和PDO分子生物學(xué)檢測，或建立臨床信息完備的PDO生物樣本庫——非營利性網(wǎng)站HUB（www.hub4organoids.eu）就是其中之一。

臨床方面，在PDO與原始腫瘤的一致性研究結(jié)果未明前展開大型臨床試驗(yàn)可能收效無幾，但仍可利用PDO模型研究大型III期臨床試驗(yàn)中失敗藥物的原因，并繼續(xù)展開PDO模型預(yù)測臨床試驗(yàn)結(jié)果一致性的研究。PDO目前應(yīng)用于臨床的另一個(gè)壁壘在于培養(yǎng)及藥敏檢測總周期約3周[13]，而利用PDO藥物敏感性進(jìn)行藥物篩選的應(yīng)用需求大多集中于在二線藥物或術(shù)后輔助治療的選擇上，若想將時(shí)間縮短至1周并用于一線藥物的選擇，仍需較大的科技創(chuàng)新。

PDO的一個(gè)關(guān)鍵缺陷在于其培養(yǎng)主要來源于上皮中的干細(xì)胞，故缺乏腫瘤微環(huán)境細(xì)胞參與。隨著免疫治療和抗血管治療在肺癌治療體系中地位的不斷攀升，研究腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的交互關(guān)系顯得尤為重要。故需完善與基質(zhì)細(xì)胞、血管干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的共培養(yǎng)體系（patient-derived organoid co-culture, PDO+）[40,41]，或利用PDO構(gòu)建小鼠移植瘤模型（xenografts that are derived from patient-derived organoids, PDO-X）[40]。

5 結(jié)論

隨著肺癌在靶向治療、免疫治療等方面不斷取得新進(jìn)展，精準(zhǔn)治療在肺癌患者的全程管理中起到越來越重要的作用。然而，由于對腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)病因研究尚有局限，尤其是對于腫瘤的分子網(wǎng)狀信號系統(tǒng)了解甚微，現(xiàn)有的“基因-藥物”精準(zhǔn)治療體系仍存在諸多邏輯上待完善的漏洞。相比之下，PDO這一腫瘤體外模型作為功能學(xué)模型可以很好地填補(bǔ)這一空缺。肺癌PDO可以通過手術(shù)切除組織、穿刺活檢、胸水等建立，成為輔助難治性肺癌選藥的新興技術(shù)。其能夠在基因組、轉(zhuǎn)錄組和翻譯產(chǎn)物上濃縮原始腫瘤的主要特征。目前肺腺癌、鱗癌、腺鱗癌、大細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌均能夠成功培養(yǎng)出PDO。如果肺癌PDO在化療、靶向治療及免疫治療敏感性方面的有效性可以在前瞻性臨床研究中得到驗(yàn)證，則其進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并進(jìn)一步用于改善肺癌患者的個(gè)性化精準(zhǔn)治療決策方案體系將指日可待。PDO在多癌種中的初步試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果令人鼓舞，并為下一步轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究提供了切實(shí)可行的理論基礎(chǔ)。

綜上，肺癌分子檢測的個(gè)體異質(zhì)性大，PDO可以作為原腫瘤的體外替身，未來幫助實(shí)現(xiàn)真正的肺癌超精準(zhǔn)個(gè)體化治療選擇。