符甜 梁愛玲 劉勇軍

根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)[1]顯示，2018年全球肺癌新增病例數(shù)占總癌癥病例數(shù)的11.6%，其中肺癌死亡人數(shù)占癌癥總死亡人數(shù)的18.4%，是全球人類發(fā)生率最高和導致癌癥死亡的主要原因。手術是早期肺癌患者的主要治療手段，但是由于肺癌患者早期癥狀不明顯，發(fā)病隱匿，大部分患者確診時往往已是中晚期。放療、化療、靶向治療和免疫治療是中晚期肺癌患者的主要治療方法，靶向治療是近十幾年來肺癌治療取得的巨大突破，免疫治療是近幾年肺癌治療的新方法。盡管這些不同的治療方法有較好的療效，能有效緩解患者痛苦并提高生存期，但是隨著病情的進展，患者在用藥一段時間后仍不可避免地出現(xiàn)獲得性耐藥，獲得性耐藥是導致臨床肺癌患者治療失敗和癌癥治療最難以克服的問題之一。因此，深入探討肺癌耐藥機制、逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥是研究肺癌的難點和熱點。

P21又叫P21Waf1/Cip1或CDKN1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A），最先被el-Deiry等[2]運用差減雜交技術發(fā)現(xiàn)，它處于野生型p53的下游，是由野生型p53活化片段基因1（wild-type p53-activated fragment, WAF1）編碼的大小為21 kDa的蛋白質(zhì)。el-Deiry等[2]發(fā)現(xiàn)p53能直接誘導p21的表達并且它可能是P53發(fā)揮抑癌作用的中介。與此同時，Harper等[3]利用酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了能編碼21 kDa的細胞周期依賴性激酶（cyclin-dependent protein, CDK）相互作用蛋白的基因，并將其命名為細胞周期依賴性激酶相互作用蛋白1（CDK interaction protein 1, CIP1）；該蛋白通過與CDKs緊密結(jié)合，從而在細胞周期中發(fā)揮負性調(diào)控作用。然而，P21還在保護細胞抵抗凋亡方面發(fā)揮著重要作用，因此P21在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤藥物治療的敏感性中也發(fā)揮著重要作用[4]。本文就P21與肺癌耐藥及其相關研究進行綜述。

1 P21蛋白的生物學功能

P21最先作為細胞周期負性調(diào)節(jié)因子被發(fā)現(xiàn)，與P53構(gòu)成細胞周期檢查點，當DNA發(fā)生損傷時，P21被激活使細胞周期阻滯直至DNA修復完成，因此它在誘導細胞衰老、凋亡、促進DNA修復、維持基因組的穩(wěn)定性等方面起重要作用[5-7]。然而，P21也能促進腫瘤細胞侵襲、抵抗凋亡，在腫瘤細胞耐藥方面發(fā)揮著不可忽視的作用[8,9]。

2 P21的調(diào)控

2.1 P53依賴途徑p53是p21的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，P21最初被認為是一種腫瘤抑制因子，是DNA損傷誘導的P53依賴細胞周期阻滯的主要介質(zhì)。P21可以與P53構(gòu)成細胞周期G1期檢查點，如圖1所示，當DNA損傷或在其他應激條件下，p53被激活，直接與p21啟動子結(jié)合而激活其表達，P21蛋白通過與CDK4、CDK6/cyclin D或CDK2/cyclin E結(jié)合，從而抑制細胞周期蛋白依賴激酶活性，使視網(wǎng)膜細胞瘤（retinoblastoma, Rb）蛋白不能被磷酸化，從而可以與轉(zhuǎn)錄因子E2F牢固結(jié)合而抑制E2F的活性，阻斷DNA復制，使細胞周期阻滯直至修復完成，這樣能減少受損DNA的復制和積累，阻止異常細胞的增殖以維持基因的保真度從而發(fā)揮抑癌作用[10]。P21主要通過阻滯細胞周期發(fā)揮抑癌作用，大部分研究表明，抑制P21表達能促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11-14]，誘導P21表達能抑制腫瘤細胞的增殖[15]。

此外，P53不僅能直接激活P21的表達發(fā)揮抑癌作用，還能通過直接與其形成復合物而發(fā)揮作用。Kim等[16]的研究結(jié)果首次闡明P53和P21共同作用的抑癌機制：P53、P21能結(jié)合Mdm2及其底物鋅指轉(zhuǎn)錄因子Slug蛋白，形成P53/P21/Mdm2/Slug復合物，促進Mdm2依賴的Slug泛素化導致其降解，由于Slug能增強腫瘤細胞的侵襲性，因此Slug泛素化過程可能有助于抑制腫瘤細胞侵襲。除此之外，P53、P21能分別與Bcl-2家族蛋白（例如Bcl-w、Bcl-XL）結(jié)合，通過形成P53/P21/Bcl-w復合物使Bax蛋白釋放，促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞的侵襲[17]。

2.2 P53非依賴途徑 P21復雜的調(diào)控途徑是使其在腫瘤中發(fā)揮雙重作用的基礎。P21還可以通過非P53依賴途徑被調(diào)控，比如：c-Myc可以直接與P21的羧基端結(jié)合，影響P21與PCNA的相互作用，降低了P21介導的DNA合成抑制作用[18]。SP1蛋白在p21啟動子的近端與啟動子富含GC的模體結(jié)合，對p21轉(zhuǎn)錄也至關重要[19]。信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription, STAT）能介導P21的轉(zhuǎn)錄、表達和核定位，從而抑制耐藥乳腺癌細胞的增殖和侵襲[20]。

3 P21與腫瘤耐藥

P21在腫瘤中具有雙重的作用，它的作用主要取決于細胞狀態(tài)及其在細胞內(nèi)的定位。2017年Manu等[21]研究發(fā)現(xiàn)抑制異丙氨酸半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶能促進P21表達，P21表達上調(diào)誘導細胞周期阻滯及激活促凋亡蛋白BNIP3（BCL2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3）誘導細胞凋亡，從而增加胰腺癌對藥物治療的敏感性。野生型p53的存在是P21發(fā)揮抑癌作用的關鍵；如果p53發(fā)生突變，P21過表達會解除復制許可，細胞增殖會增加，表現(xiàn)出一定耐藥傾向。2016年Galanos等[22]在體內(nèi)與體外實驗的研究中發(fā)現(xiàn)，在p53突變的腫瘤中，長期誘導P21過表達的細胞中，部分腫瘤細胞“躲避”了P21誘導的周期阻滯和細胞衰老，重新進入細胞周期，而且這些細胞中出現(xiàn)廣泛的DNA修復，具有更強的侵襲性，且對阿霉素、順鉑等藥物有更高的耐受能力。這表明在p53突變后，P21過表達可使DNA修復出錯和基因組不穩(wěn)定而導致腫瘤細胞更強的侵襲性和耐藥能力。因此突變型p53可能是p21由抑癌基因轉(zhuǎn)化成致癌基因的關鍵因素。

目前普遍認為胞核P21主要作用于細胞周期，抑制細胞增殖和促進凋亡，而胞質(zhì)P21能保護腫瘤細胞免受凋亡，與腫瘤細胞的耐藥相關[23,24]。2014年Huang等[25]研究發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)和胞核P21在胃癌的發(fā)展、分期、預后等中發(fā)揮相反的作用，胞核P21抑制而胞質(zhì)P21促進細胞遷移和侵襲能力。2016年Xie等[26]研究發(fā)現(xiàn)在浸潤性肥大細胞介導多西他賽耐藥的前列腺癌細胞中，通過調(diào)節(jié)P38/P53信號通路，使P21的總表達水平及胞質(zhì)水平均升高；再通過敲減P21能逆轉(zhuǎn)其耐藥。但文中未能闡明其機制。2018年Maiuthed等[27]證明了在5-氟尿嘧啶耐藥的結(jié)直腸癌細胞中，胞質(zhì)P21通過將促凋亡蛋白p-Chk2從細胞核中釋放到胞質(zhì)，使p-Chk2下游的促凋亡蛋白E2F1的激活減少，從而保護腫瘤細胞免受凋亡，介導結(jié)腸癌細胞對5-氟尿嘧啶耐藥。

圖1 P21阻滯細胞周期圖Fig 1 P21 involved in blocking the cell cycle

P21是一種核蛋白，它能否在胞質(zhì)大量累積取決于激酶在其不同位點的磷酸化，例如Akt能通過PI3K/Akt信號通路使P21磷酸化導致其在胞質(zhì)中積累[28]。P21在不同情況下發(fā)揮相反的作用可能是由于P21不同的細胞內(nèi)定位造成的。胞核P21能阻滯細胞周期、促進細胞凋亡，而胞質(zhì)P21能通過降低凋亡蛋白活性或抑制凋亡信號通路，促進腫瘤細胞增殖，保護腫瘤細胞抵抗凋亡，其表達和細胞內(nèi)定位有望作為腫瘤藥物治療敏感性的判斷指標[24,25,28]。

4 P21與肺癌耐藥

P21表達水平與肺癌細胞增殖：P21的表達水平及其在細胞內(nèi)分布與其功能密切相關。2017年Li等[29]研究發(fā)現(xiàn)miR-1236-3p和miR-370-5p可促進P21的表達，使E-cadherin表達水平上調(diào)，同時抑制cyclin D1-CDK4/CDK6，從而誘導細胞周期阻滯、細胞衰老并抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。2019年Guo等[30]研究發(fā)現(xiàn)A549細胞中抑制長非編碼RNA DANCR的水平能促進P21的表達水平增加，使細胞周期阻滯在G1期，從而抑制肺癌細胞的增殖。這說明P21表達水平與肺癌細胞增殖呈負相關。然而，2018年Su等[31]研究發(fā)現(xiàn)敲減肺癌細胞的長非編碼RNA MIR22HG后，P21表達水平升高且大部分位于細胞質(zhì)，同時促進了肺癌細胞增殖。經(jīng)過轉(zhuǎn)染P21 siRNA處理后，肺癌細胞增殖減少。這些結(jié)果表明，P21水平升高促進了肺癌細胞增殖，它的水平與肺癌細胞增殖呈正相關。

P21與肺癌耐藥：P21表達水平與肺癌化療、靶向治療、放療的敏感性相關，主要通過調(diào)節(jié)細胞周期參與肺癌耐藥。在不同的研究發(fā)現(xiàn)中，其作用和機制如表1所示[32-43]。P21的表達水平下降介導耐藥。順鉑是細胞周期非特異性藥物，是肺癌化療的常用藥物。2013年Liu等[32]研究認為上調(diào)P21表達水平能使肺癌細胞周期阻滯，抑制細胞增殖，增加肺腺細胞對順鉑敏感性。有研究[33]發(fā)現(xiàn)miR-224靶向P21使其表達水平降低，介導A549細胞對順鉑耐藥。在耐藥細胞中過表達P21后，不僅使細胞周期阻滯在G1期/S期，還降低抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表達，促進促凋亡蛋白Bax、Bak的表達，因而促進細胞凋亡從而逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥。Feng等[34]研究表明在順鉑耐藥的A549細胞中，過表達膜聯(lián)蛋白A2可激活JNK/c-Jun信號通路抑制p53的表達，進而使p21等凋亡相關基因表達下降，抑制順鉑誘導細胞凋亡，從而增強細胞對順鉑的耐受性。P21不僅參與了肺癌細胞對順鉑產(chǎn)生耐藥，也與其他藥物化療耐藥相關。2016年Shan等[35]的研究發(fā)現(xiàn)在耐甲氨蝶呤的A549細胞中，過表達miR-200c能激活P53/P21信號通路來誘導細胞周期阻滯在G0期/G1期及誘導細胞凋亡，從而逆轉(zhuǎn)耐藥。在Noro等[36]的研究中，藥物作用使p21啟動子組蛋白乙?；苷T導p21的表達來阻斷Rb-E2F1通路，從而增加肺癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。這些結(jié)果提示，P21主要通過調(diào)控不同期的細胞周期阻滯介導肺癌細胞對化療藥物治療的敏感性。

P21還影響肺癌細胞靶向治療藥物的敏感性。吉非替尼是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，能促進腫瘤細胞凋亡。2011年Zhao等[37]發(fā)現(xiàn)吉非替尼能通過P53非依賴途徑誘導PC-9細胞中P21的表達，同時CDK2/4和cyclin D1/E表達水平降低，細胞周期阻滯在G1期，抑制細胞增殖。隨后發(fā)現(xiàn)吉非替尼耐藥的PC-9細胞中藥物誘導P21的表達或直接使P21過表達均能增加細胞對吉非替尼的敏感性，這說明P21參與了PC-9細胞對吉非替尼的敏感性。此外，2015年Zhu等[38]研究發(fā)現(xiàn)，在吉非替尼耐藥的PC-9細胞中同時使用白蘆藜醇和吉非替尼，能激活P53/P21通路，誘導細胞周期阻滯在G2期/M期和細胞衰老，從而增強肺癌細胞對吉非替尼的敏感性。2017年Wang等[39]研究發(fā)現(xiàn)，與對吉非替尼敏感的PC-9細胞相比，耐藥細胞中P21蛋白水平明顯下降，通過誘導P21的表達，能降低CDK2/4和cyclin D1/E的活性或表達水平，導致細胞周期阻滯在G1期，從而逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥。這說明升高P21表達水平可以增加耐藥細胞對吉非替尼的敏感性。然而，也有相反觀點，高表達P21能介導肺癌耐藥。2015年Zhao等[40]發(fā)現(xiàn)，P21表達水平升高使細胞周期阻滯在G1期，抑制DNA的合成，再加上RAD21高表達增強了DNA的修復作用，抑制了順鉑介導的DNA損傷，從而對順鉑產(chǎn)生耐受。2018年Guo等[41]發(fā)現(xiàn)，A549細胞在低氧條件下能通過使P53表達上調(diào)從而激活P21的表達，使細胞周期阻滯在G1期/G0期，但此時卻增加了A549細胞對順鉑的耐受，其潛在的原因可能是細胞周期阻滯，導致非增殖狀態(tài)的細胞增加，減小了順鉑對A549細胞的作用。有研究[42]發(fā)現(xiàn)，Nrf-2可以通過非依賴P53途徑直接與p21啟動子結(jié)合，激活p21的表達以促進A549細胞在H2O2誘導的氧化應激下存活。由于腫瘤細胞的活性氧水平升高，同時抗氧化酶水平升高，使它們能抵抗細胞毒性化療，因此認為Nrf-2/P21途徑可能是介導肺癌細胞耐藥的原因之一。

表1 P21在肺癌耐藥中的作用及相關機制Tab 1 The role of P21 in lung cancer resistance and related mechanisms

P21還在肺癌細胞對放療的敏感性中扮演重要角色。P21表達下降或過多降解均會導致肺癌細胞耐輻射，上調(diào)P21的表達能增加非小細胞肺癌對放療的敏感性[44,45]。此外，研究[46]發(fā)現(xiàn)通過激活Akt/mTOR通路靶向P21能促進細胞增殖和誘導耐輻射。

5 總結(jié)與展望

肺癌耐藥機制復雜，大部分體內(nèi)外實驗表明，P21陽性表達是提示肺癌良好預后的標志，P21缺乏是導致肺癌細胞耐藥、耐輻射的重要原因之一，其主要機制是P21誘導細胞周期阻滯、細胞衰老和凋亡，從而逆轉(zhuǎn)耐藥。但也有研究者[46]提出，在肺癌耐藥細胞中P21表達升高使細胞周期阻滯從而介導耐藥表型。不同的研究結(jié)果可能是由于不同實驗室使用的細胞類型或細胞狀態(tài)不一所致。

由于P21在肺癌增殖中的雙重作用，P21的表達水平及其在細胞內(nèi)的定位有望作為肺癌預后的指標，但是調(diào)控P21的基因較多，特異性并不高，需要聯(lián)合其他指標。同時，P21有望作為逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥和治療的潛在靶點[47]，結(jié)合p53的狀態(tài)，在因P21缺乏而導致的耐藥和預后不良相關的細胞中應用P21誘導藥物，在P21過表達導致的耐藥細胞中使用P21抑制劑有望作為肺癌治療的新方法。我們所面臨的挑戰(zhàn)是如何能抑制P21介導的促癌和耐藥活性，但又不影響其發(fā)揮抑癌活性。深入研究P21與肺癌耐藥的關系，更好地理解P21在各種情況下的作用機制，有助于解決臨床肺癌耐藥問題，為臨床逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥和肺癌治療提供新思路。