唐天才 ， 袁東波 ， 郭 莉 ， 侯 巍 ， 莫 茜 ， 尹 杰 ， 陽愛國 ， 郝力力

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 ， 四川 成都 610041 ； 2. 四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 四川 成都 610041)

多房棘球蚴病(Alveolar echinococcosis，AE)又稱泡型包蟲病，是多房棘球絳蟲(Echinococcosismultilocularis，EM)的幼蟲泡型棘球蚴(泡球蚴)寄生在人畜體內(nèi)所致的慢性人獸共患寄生蟲病[1]，是影響當(dāng)?shù)厣鐣?huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要?jiǎng)游镆卟≈?。該病主要流行于北半球高緯地區(qū)、高寒地區(qū)或凍土地帶[2-3]，我國是世界上多房棘球蚴病高發(fā)的國家之一，其中又以四川、青海、西藏、甘肅等省區(qū)最為嚴(yán)重[4]。石渠縣位于四川省西北部，境內(nèi)平均海拔4 000 m以上，年平均氣溫約1.7 ℃，屬高寒地帶，適合多房棘球絳蟲生活。目前石渠縣是我國唯一的包蟲病防控試點(diǎn)縣，由于該地區(qū)犬只數(shù)量極大，作為該地區(qū)的主要終末宿主促進(jìn)了多房棘球蚴病的傳播和流行，因此，對(duì)犬感染情況的調(diào)查就顯得十分重要。鑒于此，本試驗(yàn)采用PCR方法對(duì)石渠縣部分地區(qū)犬糞中多房棘球絳蟲進(jìn)行檢測，旨在了解該地區(qū)犬感染多房棘球絳蟲的基本情況，為其今后泡型包蟲病的防控提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 于2016年7-9月捕捉石渠縣洛須鎮(zhèn)、格孟鄉(xiāng)、蒙宜鄉(xiāng)、宜牛鄉(xiāng)、起塢鄉(xiāng)共5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的流浪犬，每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)捕捉20只，共計(jì)100只。而后將其拴養(yǎng)，并投喂吡喹酮驅(qū)蟲，收集驅(qū)蟲后3 d內(nèi)的犬糞。且于2016-2018年連續(xù)3年的7-9月采集上述5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的家犬糞便(由四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心采集)，所有樣本放入收集管-80 ℃凍存1周以上，以滅活蟲卵。

1.1.2 主要試劑 糞便DNA提取試劑盒(QIAamP DNA Stool Kit)，1×TAE溶液，Trans 2K Plus DNA Maker，2×EasyTaqPCR Super Mix，瓊脂糖，PCR引物合成、測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司(成都公司)完成。

1.1.3 主要器材 電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-6C型)、臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf 5402 型)、Bio-Rad 伯樂梯度PCR擴(kuò)增儀(PTC240型)等。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA制備 已滅活的糞樣混勻之后取大約30 mg，按照糞便DNA提取試劑盒的說明書提取基因組總DNA，放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR檢測 本次試驗(yàn)參照Dinkel R[5]所用的巢式PCR方法進(jìn)行檢測，第1輪反應(yīng)序列為：P60.for：5′-TTAAGATATATGTGGTACAGGATTAGATACCC-3′，P375.rev：5′-ACCGAGGGTGACGGGCGGTGTGTACC-3′，片段大小372 bp；第2輪反應(yīng)序列為：Pnest.for：5′-ATATTTTGTAAGGTTGTTCTA-3′，Pnest.rev：5′-ACAATACCATATTACAACAATATTCCTATC-3′，片段大小251 bp，陽性產(chǎn)物送公司測序。

1.2.3 序列分析及感染率計(jì)算 測序結(jié)果用DNASTAR軟件進(jìn)行拼接分析，在NCBI中BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)。再根據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算感染率。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測 以犬糞便DNA為模板，運(yùn)用巢式PCR擴(kuò)增線粒體12S rRNA基因片段，于約251 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小相符(圖1)。

圖1 多房棘球絳蟲線粒體12S rRNA基因巢式PCR擴(kuò)增后電泳圖

2.2 犬多房棘球絳蟲感染情況 調(diào)查結(jié)果如表1所示，在時(shí)間維度上，家犬多房棘球絳蟲感染率呈逐年下降的趨勢，其2016年、2017年、2018年的感染率分別為14.57%、7.86%、4.00%。在地理分布上，不同地點(diǎn)的感染率存在差異。在終末宿主上，2016年流浪犬的感染率顯著的高于家犬，其總感染率分別為流浪犬35.00%、家犬14.57%。

表1 犬多房棘球絳蟲感染率統(tǒng)計(jì)

2.3 進(jìn)化樹分析 所有樣本測序后，經(jīng)兩兩比對(duì)只得2條序列，分別命名為E.m.shiqu1和E.m.shiqu2，同源性為99%。2個(gè)序列在NBCI BLAST在線比對(duì)后，E.m.shiqu1與分離自德國(EU043372)、瑞士(JN175268)以及青海(KY321841)的多房棘球絳蟲同源性最高，均為100%，覆蓋率99%。而E.m.shiqu2與分離自波蘭(KF171965)的多房棘球絳蟲同源性最高，達(dá)99.60%，覆蓋率99%；與分離自日本(AB243207)的多房棘球絳蟲同源性為99.20%，覆蓋率99%。將2個(gè)測定序列與GenBank中同源性最高的序列以及國內(nèi)外不同地點(diǎn)的多房棘球絳蟲序列，構(gòu)建進(jìn)化樹。如圖2所示，2個(gè)分離株與國內(nèi)外不同時(shí)間、不同地點(diǎn)分離到的多房棘球絳蟲位于同一大支，親緣關(guān)系近；與分離自四川的細(xì)粒棘球絳蟲(E.g.JN981128)不在同一大支，親緣關(guān)系遠(yuǎn)。

圖2 基于12S rRNA構(gòu)建的多房棘球絳蟲進(jìn)化樹

3 討論

目前，檢測犬糞中多房棘球絳蟲的方法有犬糞抗原ELISA方法和分子生物學(xué)方法[6]。前者雖有操作簡單、快捷、對(duì)試驗(yàn)設(shè)備要求簡單、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，但仍具有一定的缺點(diǎn)：首先與親緣關(guān)系較近的細(xì)粒棘球絳蟲易發(fā)生交叉反應(yīng)，使其特異性降低；再者此方法的敏感性與蟲體負(fù)荷量有關(guān)，當(dāng)蟲體數(shù)量較少時(shí)不易檢出，易發(fā)生漏檢現(xiàn)象。Raoul等[7]利用糞抗原-ELISA技術(shù)檢測多房棘球絳蟲感染狐貍的糞抗原時(shí)，認(rèn)為其敏感性與蟲體負(fù)荷有關(guān)，當(dāng)蟲體數(shù)為1～25條時(shí)，此方法的敏感性為(31.1±8.64)%，當(dāng)蟲體數(shù)>50條時(shí)敏感性為(81.8±0.66)%，當(dāng)蟲體數(shù)>100條時(shí)敏感性可達(dá)(100±0.34)%。本次調(diào)查所用的巢式PCR方法，通過兩輪反應(yīng)克服了單次擴(kuò)增平臺(tái)期效應(yīng)的限制，使擴(kuò)增倍數(shù)提高，從而極大地提高了PCR的敏感性。Dinkel等[5]應(yīng)用巢式PCR對(duì)狐貍糞便進(jìn)行檢測，其敏感度可達(dá)對(duì)1個(gè)蟲卵的檢測。其次第2輪反應(yīng)引物和模板的改變，降低了非特異性反應(yīng)連續(xù)放大的可能性，保證了反應(yīng)的特異性。

調(diào)查結(jié)果顯示，石渠縣流浪犬多房棘球絳蟲的感染率為35%，與2000年黃燕等[8]對(duì)甘孜縣流浪犬調(diào)查的感染率34.8%(8/23)相近，說明長期以來甘孜州流浪犬可能處于較高的感染水平；此外，在2016年流浪犬的感染率顯著的高于家犬。以上2個(gè)現(xiàn)象可能是因?yàn)榱骼巳承噪s、食譜廣，從未驅(qū)蟲；其次流浪犬與野生嚙齒動(dòng)物在同一環(huán)境中生存，勢必會(huì)發(fā)生流浪犬捕食野生嚙齒動(dòng)物的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致多房棘球絳蟲的野生循環(huán)，這也是流浪犬的感染率居高不下的最重要因素。反之高感染率的流浪犬又增加了環(huán)境污染的機(jī)會(huì)，給當(dāng)?shù)啬撩駧砹溯^高被感染的風(fēng)險(xiǎn)。另外，在本調(diào)查中5個(gè)地區(qū)家犬與流浪犬的感染率存在較大差異，正如劉輝等的報(bào)道[9]：多房棘球絳蟲的分布在較小的地域范圍內(nèi)也有很大差異，可能與中間宿主嚙齒類動(dòng)物在不同生態(tài)環(huán)境中的分布差異有關(guān)。據(jù)調(diào)查石渠縣有野生嚙齒類動(dòng)物近13億只，但分布不均，在純牧區(qū)的草原地帶分布密集，而在半農(nóng)牧區(qū)的高山峽谷帶分布則相對(duì)稀疏，這也是位于半農(nóng)牧區(qū)的洛須鎮(zhèn)家犬與流浪犬的感染率均是最低的原因之一。

家犬的感染率下降，說明近幾年在有關(guān)部門的防控力度不斷加大以及以“雙滅源”、“三切斷”、“八舉措”為主的“238”高寒藏區(qū)畜間包蟲病防控新模式[10]取得了顯著的成效，但由于石渠縣面積大、野生動(dòng)物種類及數(shù)量多、環(huán)境復(fù)雜，所以形勢依然嚴(yán)峻，需持續(xù)監(jiān)測。此外，還應(yīng)繼續(xù)做好犬只的驅(qū)蟲和管理工作，從而更加切實(shí)有效的防控泡型包蟲病。