樊曉旭 ， 趙 明 ， 趙永剛 ， 張志誠 ， 吳曉東 ， 王志亮

(1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 ， 山東 青島 266032 ； 2. 青島市動物疫病預(yù)防控制中心 ， 山東 青島 266100)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染家豬和野豬(如歐亞野豬)引起的一種急性、熱性、烈性傳染病。該病致死率高達(dá)100%。一旦暴發(fā)，往往給受災(zāi)國家和地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)造成不可估量的損失和影響。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報(bào)告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。自 1921 年首次報(bào)道以來，非洲豬瘟從非洲傳播至歐洲、南美洲、亞洲等的多個國家。近一年來，非洲豬瘟病毒傳播速度明顯加快，呈現(xiàn)愈演愈烈之勢。據(jù)OIE 通報(bào)數(shù)據(jù)顯示，2019年1-12月期間，曾暴發(fā)或者正在暴發(fā)非洲豬瘟疫情的國家有28個,包含歐洲國家13 個、亞洲國家12個和非洲國家3 個，其中亞洲幾個國家的疫情尤為嚴(yán)重。由于至今依然缺乏公認(rèn)安全有效的疫苗和藥物用于預(yù)防、控制和治療非洲豬瘟，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早處置、提高生物安全管理水平是目前非洲豬瘟防控的主要措施。其中，準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測方法，對于非洲豬瘟的防控至關(guān)重要。

本文檢索了美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫1960-2019年收錄的有關(guān)非洲豬瘟診斷方法方面的試驗(yàn)性文章，選取的關(guān)鍵詞為“African swine fever”，同時包含“diagnosis”或“detection”，排除綜述類、非診斷研究類文章，共納入文章103篇。其中，病原學(xué)檢測方法72篇，血清學(xué)檢測方法31篇。20世紀(jì)60年代10篇、70年代12篇、80年代12篇、90年代19篇、21世紀(jì)00年代17篇、10年代33篇。從發(fā)表文章數(shù)量可以看出，非洲豬瘟檢測相關(guān)文章總體呈現(xiàn)上升趨勢，特別是在最近10年，文章數(shù)量明顯上升(見中插彩版圖1)。非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室診斷方法按照時間可大致劃分為3個階段：20世紀(jì)60-70年代，主要利用病毒本身特性，例如血吸附性、感染致細(xì)胞病變(CPE)，以及抗原抗體特異性結(jié)合原理，輔以瓊脂擴(kuò)散、沉淀、放射性擴(kuò)散、電泳、熒光素標(biāo)記等手段，對ASF病原及抗體進(jìn)行檢測。20世紀(jì)80-90年代，一方面，ELISA、免疫印跡方法進(jìn)一步發(fā)展，逐漸成為主流的血清學(xué)檢測方法；另一方面，除了建立直觀顯微觀察CPE和夾心ELISA方法外，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA分子雜交和PCR技術(shù)也逐步應(yīng)用到ASFV病原學(xué)檢測中。21世紀(jì)最初20年，普通PCR技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)以及各種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)得到長足發(fā)展，檢測的靈敏性得到顯著提高。通過化學(xué)發(fā)光、免疫微球和膠體金技術(shù)，使基于抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的診斷技術(shù)操作更加便捷。多重PCR、微陣列和液相芯片技術(shù)，使同一時間檢測多種病原成為可能。本文以時間為主線，回顧非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測方法的發(fā)展歷程，以期為非洲豬瘟的診斷乃至防控提供參考。

1 20世紀(jì)60-70年代

1960年，Malmquist和IHay發(fā)現(xiàn)正常的豬紅細(xì)胞會吸附在感染非洲豬瘟病毒的細(xì)胞表面，且大多數(shù)ASFV分離株都會產(chǎn)生這種現(xiàn)象。從NCBI數(shù)據(jù)庫中可查，1965年，前蘇聯(lián)科學(xué)家報(bào)道了通過紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)(HAD)鑒定非洲豬瘟病毒[1]。盡管并不是所有的非洲豬瘟病毒都具有血吸附特性，但該方法迄今依然是鑒定病毒、測定病毒含量(HAD50)的重要手段。非洲豬瘟病毒在原代豬腎細(xì)胞中傳代，盡管病毒毒力發(fā)生一定變化，但紅細(xì)胞吸附能力依然保留。1966-1967年，法國Boulanger等利用當(dāng)時流行的試驗(yàn)技術(shù)，報(bào)道了各種非洲豬瘟病毒的檢測方法[2]。例如，利用改良的直接補(bǔ)體固定試驗(yàn)或瓊脂凝膠雙擴(kuò)散技術(shù)，可成功檢測到病豬脾臟和肝臟中的病毒抗原。將異硫氰酸熒光素與血清偶聯(lián)建立免疫熒光檢測病毒抗原的方法，能夠檢測到冷凍組織切片、血涂片和培養(yǎng)細(xì)胞物中病毒抗原，不受豬體中抗體的干擾。同時，利用不同顏色的熒光素偶聯(lián)，能夠區(qū)分非洲豬瘟和古典豬瘟病毒(CSFV)抗原，也是最早報(bào)道的非洲豬瘟與其他病原的實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷方法[3]。而經(jīng)過不斷的優(yōu)化和改進(jìn)，直接免疫熒光法(FAT)目前仍是直觀觀測非洲豬瘟病毒在組織細(xì)胞中分布的重要手段。

在20世紀(jì)70年代，涌現(xiàn)出多種ASF抗體檢測方法。免疫電滲電泳方法被應(yīng)用于ASF特異性抗體的檢測，反應(yīng)僅耗時30 min。此外，西班牙實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了高丙種球蛋白血癥與碘凝集試驗(yàn)、反向單向放射免疫擴(kuò)散等方法用于檢測血清中的抗體。間接免疫熒光和微型血清樣品承載波片用于大規(guī)模的抗體監(jiān)測工作[4]。1979年，人們開發(fā)了一種同時檢測非洲豬瘟病毒抗原和抗體的固相放射免疫分析方法(RIA)，可最低檢測到相當(dāng)于50～500 HAD50/mL的抗原濃度。這種直接或間接抗體RIA，比現(xiàn)有的補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)靈敏約100倍，比免疫電滲電泳抗體檢測方法敏感1 000倍，且方法的重復(fù)性良好[5]。隨著酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的發(fā)明，在1979年，文章首次報(bào)道了ELISA在ASF檢測中的應(yīng)用。Wardley等對ELISA方法進(jìn)行了進(jìn)一步評價，證實(shí)該方法最低能夠檢測到50～500 HAD50/mL抗原，且比目前ASF抗體檢測方法更為靈敏[6]。進(jìn)而，《OIE陸生動物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊》中也對該方法進(jìn)行了描述，認(rèn)為ELISA可分別用于血清和組織液中抗體及抗原的檢測。

2 20世紀(jì)80-90年代

到了20世紀(jì)80年代，一方面，科學(xué)家們對現(xiàn)有的ELISA、RIA方法進(jìn)一步做了臨床應(yīng)用評價和改進(jìn)；另一方面，一些新技術(shù)也逐漸應(yīng)用到ASF檢測中。例如，簡化了免疫電滲電泳檢測方法，并開發(fā)了間接免疫過氧化物酶斑點(diǎn)染色法(IPT)用于檢測非洲豬瘟病毒抗體。在敏感性和特異性方面，該方法與間接免疫熒光法相當(dāng)，可用于抗體監(jiān)測及確診。1987年，荷蘭Knudsen等開發(fā)了豬單核白細(xì)胞(MNL)微培養(yǎng)測定ASFV含量的方法。通過倒置顯微鏡放大40倍，觀察ASFV感染單核細(xì)胞后的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。感染單核細(xì)胞開始分離、擴(kuò)大和變圓，逐漸形成葡萄狀的3～20個或更多的細(xì)胞團(tuán)，最終裂解。值得注意的是，強(qiáng)毒株、中等毒力毒株、Vero細(xì)胞適應(yīng)株和無紅細(xì)胞吸附特性毒株都可產(chǎn)生特征性CPE。這種細(xì)胞病變微量測定法(TCID)的靈敏度和重復(fù)性與HAD法相近[7]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，針對非洲豬瘟檢測，也相應(yīng)開發(fā)制備了多種檢測材料。例如，針對非洲豬瘟病毒14、32、73、174 kDa和240 kDa蛋白制備了一系列單克隆抗體，可應(yīng)用到免疫電子顯微鏡觀察和放射免疫分析中。荷蘭科學(xué)家利用抗IgG和IgM混合單抗建立的同種型特異性免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)方法，其敏感性高于ELISA，可用于血清學(xué)篩查[8]。奧地利實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了含有非洲豬瘟病毒西班牙70株H-ClaI基因片段(5.6 kbp)的pRPEL2重組質(zhì)粒，采取磷32標(biāo)記雜交探針，開發(fā)了DNA-DNA雜交方法。利用硝酸纖維素紙固定ASFV DNA，最低檢出限達(dá)20 pg。相比之下，非放射性磺化DNA探針的靈敏度約為4 ng，生物素化DNA探針的靈敏度約為400 pg[9]。20世紀(jì)80年代末，建立了采用免疫印跡法檢測非洲豬瘟病毒抗體，并進(jìn)一步研究確定了檢測方法的干擾因素、電轉(zhuǎn)及免疫反應(yīng)條件、膜材料，證實(shí)病毒p30蛋白敏感性最佳[10]。

1990年，西班牙利用臨床血清樣品，對放射免疫沉淀法(RIPA)、免疫印跡和ELISA進(jìn)行了比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種方法的敏感性相當(dāng)，RIPA和ELISA方法較免疫印跡更早檢測到ASF抗體陽性[11-12]。在比較了感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)可溶性部分(CS-P)和半純化病毒結(jié)構(gòu)蛋白p72作為抗原建立的2種ELISA抗體檢測法后，發(fā)現(xiàn)豬血清CS-P在感染豬的早期血清學(xué)檢測中更具優(yōu)勢。此外，在硝酸纖維素條上結(jié)合CS-P，建立簡易斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)方法(DIA)，便于ASF抗體的檢測。在一項(xiàng)ASFV病原檢測比較研究中發(fā)現(xiàn)，夾心ELISA方法的檢測限為2.3×102HAD50，免疫斑點(diǎn)法檢測限為4.6×102HAD50，放射性DNA探針分子雜交檢測限約為1.8×103HAD50[11]。夾心ELISA方法在檢測人工感染ASFV后8 d之內(nèi)的樣本，出現(xiàn)了一部分假陰性結(jié)果，而在接毒后9～14 d，采集的樣本均呈陽性。與病毒分離相比，ELISA方法需要的專業(yè)設(shè)施更少，檢測耗時更短。但是，在ASF亞急性感染過程中形成了病毒抗體免疫復(fù)合物，導(dǎo)致免疫學(xué)方法出現(xiàn)漏檢情況，提示分子雜交方法檢測病毒DNA更有效。

1992年，西班牙Fernandez等首次報(bào)道了利用免疫組織學(xué)切片方法檢測研究ASFV抗原，通過戊二醛固定含病毒組織，石蠟包埋，多克隆抗體檢測，可觀察組織超微結(jié)構(gòu)中的病毒分布[13]。通過對不同地區(qū)、不同年份分離到的不同ASF野毒株的基因序列比較分析，發(fā)現(xiàn)編碼ASF病毒蛋白p54和p30的基因E183L和CP204L高度保守。為了避免在生產(chǎn)過程中使用活病毒，通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，改進(jìn)了Western Blot檢測方法。臨床驗(yàn)證結(jié)果顯示，p54可作為Western Blot檢測ASF抗體的首選抗原，而p30更適于ELISA方法檢測抗體的候選抗原，特別是病毒感染早期的抗體檢測[14]。ASFV p72蛋白在世界各地分離的毒株中高度保守(97.8%～100%的氨基酸序列同源性)，利用抗p72的單克隆抗體建立的夾心ELISA，對p72抗原檢測限為0.05 μg/mL，低于多克隆抗體的0.6 μg/mL檢測限，可檢測2.3×102PFU/mL全病毒粒子[15]。

在非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室診斷中，具有跨時代意義的標(biāo)志是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)于1992年首次應(yīng)用到ASFV檢測中，瑞典Steiger等針對病毒基因組保守區(qū)640 bp片段設(shè)計(jì)了1對引物，成功檢測到病毒感染的組織、全血及細(xì)胞培養(yǎng)物，之后采用巢式PCR和生物素化寡核苷酸探針雜交對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證[16]。此外比較發(fā)現(xiàn)，PCR方法比HAD方法更快速、更靈敏，同時可采用病毒DNA克隆作為陽性對照，代替以往HAD方法的活病毒對照，在檢測操作過程中更加安全。

3 21世紀(jì)最初20年

進(jìn)入21世紀(jì)，基于PCR原理的ASFV診斷方法得到長足發(fā)展。特別是在馬達(dá)加斯加臨床分離到的ASFV毒株，在細(xì)胞內(nèi)的生長沒有表現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變或血液吸附作用，提示PCR和核苷酸測序方法在診斷中的必要性。為了避免由于反應(yīng)過程本身出現(xiàn)問題導(dǎo)致樣品檢測出現(xiàn)假陰性，法國Gonzague等及英國King等分別在普通PCR方法和TaqMan熒光定量PCR方法中設(shè)置了內(nèi)控品[17-18]。比利時Tignon等建立了含有豬肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參的熒光定量PCR方法，經(jīng)不同參考實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，檢測限為5.7～57個基因組拷貝[19]。2013年, Fernandez-Pinero等針對ASFV p72片段設(shè)計(jì)了通用探針(UPL)，并附有β-actin作為內(nèi)參質(zhì)控，通過檢測分屬19個基因型的臨床樣本，驗(yàn)證其適用性，結(jié)果顯示，比OIE推薦的TaqMan法靈敏性更高，具有良好的重復(fù)性和可靠性，目前得到多個實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用[20]。TaqMan熒光定量PCR方法靈敏性高，可在試驗(yàn)感染豬發(fā)病前2～4 d在扁桃體刮片樣本中檢測到病毒核酸，檢測時間不超過2 h。在靈敏性提升方面，Bastos等進(jìn)一步利用巢式PCR技術(shù)，結(jié)合內(nèi)控品，提高了靈敏性，可用于檢測軟蜱樣品中微量的ASFV核酸[21]。英國McKillen等開發(fā)了針對ASFV 9GL基因的5′小溝結(jié)合(MGB)探針熒光定量PCR方法，探針設(shè)計(jì)長度更短，提高了探針設(shè)計(jì)的靈活性；探針包括一個不發(fā)光的猝滅基團(tuán)(NFQ)，極大消除傳統(tǒng)猝滅基團(tuán)產(chǎn)生的背景熒光，提高信噪比，從而提高了檢驗(yàn)靈敏度，檢測限達(dá)20個基因組拷貝，較OIE推薦的PCR方法靈敏10倍[22]。Ronish等開發(fā)了指數(shù)后線性PCR(LATE PCR)，并含有內(nèi)控DNA，能夠直接擴(kuò)增大量單鏈DNA，并在擴(kuò)增后讀取熒光信號，檢測限為1～10個基因組拷貝，整個擴(kuò)增反應(yīng)約為1 h，適于實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場快速診斷[23]。利用凍干技術(shù)，將熒光定量PCR酶制成粉末，在運(yùn)輸和保存中，可進(jìn)一步確保反應(yīng)效果。2017年，中國Luo等對普通PCR方法進(jìn)行了優(yōu)化，分析檢出限達(dá)60拷貝[24]。2018年，中國Wu等建立了ASFV微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(ddPCR)方法，檢測限為10拷貝/反應(yīng)[25]。

南非Bastos等建立了一種基于PCR的測序方法，擴(kuò)增與p72基因C末端478 bp片段，除了確認(rèn)病毒的存在，還通過核苷酸序列測定和系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)一步鑒定毒株遺傳特征，確定其基因型，便于后續(xù)的ASF分子流行病學(xué)研究。該方法至今依然是主要的ASFV基因分型方法，根據(jù)此方法，目前全世界非洲豬瘟病毒可分為24個基因型[26]。瑞典Leblanc等利用液相芯片方法，根據(jù)p72基因C末端的序列變異確定的基因型分類標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)計(jì)了長度為15 bp或17 bp的互補(bǔ)配對DNA探針，保留了中心位置的單核苷酸多態(tài)性(SNP)差異。共設(shè)計(jì)了52個探針，24個SNP對，4個通用檢測探針[27]。使用xMAP技術(shù)，探針與微球共價連接，與PCR產(chǎn)物雜交，分析儀中讀取結(jié)果。通過檢測不同基因型臨床樣品發(fā)現(xiàn)，該方法能夠檢測和區(qū)分當(dāng)時所有22個基因型。上述基因分型為確定毒株的地理分布提供了幫助和參考。2019年，美國梅島動物疫病中心利用牛津納米孔微子序列傳感裝置作為快速測序工具，結(jié)合的新軟件腳本，開發(fā)了非洲豬瘟快速分析測序軟件工具(ASF-Fast)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時分析輸出數(shù)據(jù)。通過去除提取核酸中宿主甲基化DNA，對血液樣本和細(xì)胞培養(yǎng)分離物中的ASFV基因組序列，6 min內(nèi)可檢測到ASFV的特異性標(biāo)記。在10 min內(nèi)確保得到足夠的序列用于全基因組分析[28]。

為了滿足現(xiàn)場診斷需要，英國Hjertner等開發(fā)了一種Invader等溫?cái)U(kuò)增方法，不依賴昂貴精密的PCR儀器，但是，該方法耗時較長，需要在63 ℃下孵育12 h，每20 min收集熒光信號，且靈敏性不如PCR方法，檢測限為2 500個基因組拷貝[29]。英國King團(tuán)隊(duì)以ASFV拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ基因?yàn)榘悬c(diǎn)，建立了ASF環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法。分析靈敏度至少為330個基因組拷貝，與熒光定量PCR法有很好的一致性，有望應(yīng)用在現(xiàn)場快速診斷[30]。波蘭科學(xué)家開發(fā)了交叉啟動擴(kuò)增(CPA)，該方法可在水浴56 ℃啟動反應(yīng)，耗時45 min，最低檢測限達(dá)720拷貝/反應(yīng)[31]。相類似的是該國科學(xué)家又開發(fā)了聚合酶交聯(lián)螺旋反應(yīng)(PCLSR)，反應(yīng)耗時與檢出限與CPA相當(dāng)，可利用SYBR Green I熒光染料顏色變化或電泳對結(jié)果進(jìn)行判定[32]。通過對LAMP和CPA進(jìn)行臨床驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，其靈敏度分別達(dá)90%和70%。目前適用于ASF的初步診斷，但仍需進(jìn)一步改進(jìn)以提高其診斷的敏感性。中國、西班牙、瑞典科學(xué)家聯(lián)合開發(fā)了ASFV和CSFV雙重實(shí)時PCR方法(稱為“T-COR4分析”)，擴(kuò)增反應(yīng)可在一個便攜式、電池驅(qū)動的PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行，從樣品處理到讀取結(jié)果共需3 h[33]。2017年，中國Wang等基于重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)，建立了一種快速、特異的ASFV檢測方法。采用Genie-III掃描儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。利用含有ASFVp72片段的重組質(zhì)粒作為模板，在10 min內(nèi)即可檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測限為100 拷貝/反應(yīng)，靈敏度與熒光定量PCR相當(dāng)[34]。中國Miao等建立的重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)聯(lián)合側(cè)流檢測試紙條(LFD)快速檢測方法，在38 ℃條件下，檢測限為100 拷貝/反應(yīng)，與熒光定量PCR的陽性率符合率為100%[35]。2018年，意大利Biagetti等建立了一種基于生物傳感器的嵌合DNA/LNA方法檢測豬血液中ASFV DNA。該生物傳感器包含鎖核酸單鏈DNA探針，可識別ASFVp72基因保守區(qū)，并用qPCR定量方法對該生物傳感器進(jìn)行了校準(zhǔn)，檢測限達(dá)178拷貝/μL，其中，該方法生物素和探針固定需要60 min，之后每個樣本檢測僅需5 min。對ASFV的檢出限達(dá)10拷貝/μL，一次最多檢測40個樣品[36]。Ye等開發(fā)的便攜式微流控環(huán)形熒光探針介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增(CFPA)系統(tǒng)，所需閾值時間中位數(shù)為10.8 min，檢測限為10拷貝/μL，穩(wěn)定性良好(CV<5%)，臨床樣品檢測顯示靈敏度為92.73%，特異性為100%[37]。

在基于PCR原理的多重鑒別診斷方法中，西班牙Aguero等建立并驗(yàn)證了多重RT-PCR方法，可同時鑒別診斷ASFV和CSFV。開發(fā)的多重PCR方法檢測對5種病毒CSFV、ASFV、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PPRV)和豬細(xì)小病毒(PPV)基因，實(shí)現(xiàn)了檢測方法的高通量，但是其靈敏性受到影響，檢測限較單重PCR方法升高了1～2個數(shù)量級[38]。英國Haines等建立了同時檢測ASFV、CSFV、外源性RNA內(nèi)控的三重?zé)晒舛縋CR方法，對ASFV和CSFV的檢測限分別為22個和5個基因組拷貝，臨床樣品驗(yàn)證顯示方法的靈敏性和特異性與標(biāo)準(zhǔn)的普通PCR方法相當(dāng)，滿足臨床對2種豬病的鑒別需求[39]。我國科學(xué)家建立的多重PCR方法，對CSFV、ASFV、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)、PRRSV和偽狂犬病病毒(PRV)的最低檢測限分別為1.09×104、1.50×103、2.10×103、1.30×103拷貝/反應(yīng)和8.97×102拷貝/反應(yīng)。此外，基于GeXP基因表達(dá)譜儀，進(jìn)一步建立了一種同時檢測和鑒別7種豬病原的高通量方法。包括PRV、CSFV、ASFV、PRRSV、PPV、PCV-2和日本腦炎病毒(JEV)，對每個病原的靈敏性達(dá)1 000拷貝/反應(yīng)[40]。同樣，通過建立上述7種病原多重PCR，將PCR產(chǎn)物雜交成微球與探針偶聯(lián)，再用Bio-Plex懸浮陣列系統(tǒng)進(jìn)行檢測，檢出限與基于GeXP基因表達(dá)譜儀方法相當(dāng)。將RT-PCR與自動電子微陣列技術(shù)結(jié)合，自動完成探針捕獲、雜交，清洗和報(bào)告，可同時檢測豬的7種重要病毒：口蹄疫病毒(FMDV)、豬水泡病病毒(SVDV)，豬水皰性疹病毒(VESV)、ASFV、CSFV、PRRSV和PCV-2，其中，對ASFV的檢出限達(dá)10拷貝/μL。利用xMAP液相芯片技術(shù)，將探針與熒光羧化微球偶聯(lián)，同時檢測藍(lán)舌病病毒、鹿的流行性出血熱病毒、非洲豬瘟病毒、西尼羅河熱病毒等10種蟲媒病毒目的基因，靈敏性達(dá)10拷貝/μL[41]。2019年，加拿大開發(fā)了多重檢測工作站，包括了CSFV、ASFV、SVDV、FMDV、水泡性口炎病毒(VSV)，用戶只需添加樣品和試劑，從核酸提取、多重RT-PCR、反向斑點(diǎn)雜交檢測到結(jié)果報(bào)告，完全實(shí)現(xiàn)自動化。整個過程耗時約6 h，可同時處理24個不同組織類型的樣品[42]。

在抗體檢測方面，俄羅斯通過將ASFV基因CP204L(p30)的中心親水區(qū)克隆到原核載體中，表達(dá)高純度重組p30，診斷特異性為98.75%，敏感性為100.00%。在感染后6～8 d內(nèi)，可從家豬和野豬采集的免疫系統(tǒng)器官和血清樣本中檢測到ASFV特異性抗體[43]。在大規(guī)模抗體監(jiān)測方面，由于血清樣品腐敗變質(zhì)，常導(dǎo)致基于p30、p54蛋白建立的ELISA方法結(jié)果出現(xiàn)假陽性，通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)pp62蛋白，建立ELISA方法，提高了檢測腐敗血清樣品的準(zhǔn)確性，其原因推測是pp62比p30、p54更大、抗原表位更多，表現(xiàn)的抗原性更強(qiáng)[44]。此外，推薦pB602L和pK205R蛋白表達(dá)也可用于ELISA方法檢測ASF抗體。Aira等利用液相芯片技術(shù)，將ASFV p72和p30蛋白，以及CSFV的E2蛋白分別與微球偶聯(lián)，相應(yīng)與市售的抗ASFV或CSFV抗體ELISA試劑盒做比較，發(fā)現(xiàn)檢測ASFV抗體的靈敏度為97.3%，特異性為98.3%，檢測CSFV抗體的靈敏度為95.7%，特異性為99.8%。這種雙重檢測方法可以同時區(qū)分抗ASFV和CSFV的抗體，為監(jiān)測研究提供了有價值的工具，并有助于與ASF和CSF鑒別診斷[45]?；贏SFV p72蛋白，西班牙INGENASA實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了用于抗原檢測的橫向流動分析法(LFA)。盡管不如PCR方法敏感，但檢測臨床樣品發(fā)現(xiàn)，LFA與ELISA相關(guān)性良好，且敏感性高于ELISA，檢測限達(dá)104HAU?；诖?，還進(jìn)一步開發(fā)了能夠同時鑒別診斷ASFV和CSFV的雙重LFA[46]。2015年，歐盟利用785份臨床和試驗(yàn)樣本對現(xiàn)有的非洲豬瘟診斷方法進(jìn)行了評價，結(jié)果顯示，相比OIE推薦的King等方法，UPL-PCR敏感性更高，在早期檢測和對感染康復(fù)的豬樣本檢測方面更具優(yōu)勢。間接免疫過氧化物酶試驗(yàn)(IPT)比ELISAs更敏感，能夠在血清學(xué)反應(yīng)的早期檢測到ASF抗體。推薦UPL-PCR結(jié)合IPT，用于ASF的實(shí)驗(yàn)室診斷[47]。

4 思考與展望

自非洲豬瘟2007年傳入高加索地區(qū)格魯吉亞，并向歐洲、亞洲蔓延，2010年后，發(fā)表的有關(guān)非洲豬瘟診斷方法的文章數(shù)量也明顯增多，從這個角度也反映出非洲豬瘟的全球關(guān)注度持續(xù)升高?？煽康脑\斷方法在當(dāng)前非洲豬瘟防控和國際貿(mào)易中發(fā)揮著重要作用。可以看到，非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室診斷新方法的出現(xiàn)，離不開理化技術(shù)的發(fā)展、新型儀器設(shè)備的開發(fā)。與此同時，雖然一些方法，如HAD、FAT、ELISA、IPT、IB，早在20世紀(jì)60-90年代就已問世，經(jīng)過了長期的應(yīng)用和檢驗(yàn)，《OIE陸生動物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊》仍將其列為不同情形目的下推薦的診斷方法(表1)。而值得注意的是，手冊中顯示，至今沒有任何一種方法可以適用于評價個體或群體疫苗接種后的免疫狀態(tài)[48]。

表1 非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測方法特征

我國生豬養(yǎng)殖場戶中99%以上是中小散養(yǎng)戶，防疫意識普遍不強(qiáng)，生物安全水平不高，應(yīng)對非洲豬瘟防范能力較差，難以及時發(fā)現(xiàn)并初步判斷病情、采取有效控制措施。在未來，需要我們進(jìn)一步開發(fā)、驗(yàn)證、評價、快速的檢測方法，來滿足現(xiàn)場檢測的需求。同時，在確保方法快速、特異、靈敏的前提下，可開發(fā)多個病原的高通量檢測方法，更好的滿足未來養(yǎng)殖、檢疫等領(lǐng)域需求。此外，在養(yǎng)殖場日常監(jiān)測中，利用視頻監(jiān)控、互聯(lián)網(wǎng)、生物傳感器和人工智能等技術(shù)，監(jiān)控并量化分析動物行為和日常活動，實(shí)現(xiàn)對動物傳染病的實(shí)時早期監(jiān)測，并及時發(fā)出預(yù)警，同時結(jié)合便捷準(zhǔn)確的診斷方法，提高非洲豬瘟早期發(fā)現(xiàn)的機(jī)率。