賈瑞璞 ， 凌小雅 ， 孫雨晨 ， 尹 偉 ， 范闊海 ， 孫 娜 ， 孫耀貴 ， 李宏全

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 山西 太谷 030801)

以補(bǔ)體受體Ⅰ型(Complement receptor 1，CR1)為基礎(chǔ)的紅細(xì)胞免疫粘附是人紅細(xì)胞最重要的免疫功能。非人靈長類動物的紅細(xì)胞免疫粘附受體是一種分子量相對較小的蛋白，稱作CR1-like。獸醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，許多禽類[1～2]、嚙齒類[3]、靈長類[4]等動物疾病過程中都存在紅細(xì)胞免疫功能的變化。1983年，以狒狒和恒河猴作為研究對象，證實(shí)了靈長類動物的紅細(xì)胞可以在體內(nèi)循環(huán)中攔截補(bǔ)體固定的免疫復(fù)合物(Immune complex，IC)，粘附著IC的紅細(xì)胞將其運(yùn)送至肝臟并返回至循環(huán)系統(tǒng)中，這種紅細(xì)胞-IC的清除機(jī)制在IC沉積介導(dǎo)的疾病中是至關(guān)重要的[5]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究工作證實(shí)，豬紅細(xì)胞也具有免疫粘附功能，豬紅細(xì)胞CR1-like可粘附血清致敏的熒光大腸桿菌，并通過免疫沉淀技術(shù)進(jìn)一步對豬紅細(xì)胞膜總蛋白分析發(fā)現(xiàn)，CR1-like是豬紅細(xì)胞發(fā)揮免疫粘附功能的分子基礎(chǔ)[6-8]。

但總體而言，豬的紅細(xì)胞雖然具有免疫功能，但是豬紅細(xì)胞發(fā)揮免疫粘附功能的分子基礎(chǔ)及其結(jié)構(gòu)特征尚不清楚，豬紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移遞呈IC的機(jī)制研究近乎空白，為了深入研究豬紅細(xì)胞免疫粘附的分子學(xué)基礎(chǔ)，本試驗(yàn)構(gòu)建了CR1-like基因的酵母雙雜交誘餌載體，并且對誘餌質(zhì)粒進(jìn)行了自激活和毒性檢測，為利用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)一步研究CR1-like發(fā)揮免疫粘附功能的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌株、質(zhì)粒及主要試劑 酵母菌株Y2HGold、誘餌載體pGBKT7、酵母培養(yǎng)基、X-α-Gal、金擔(dān)子素(Aureobasidia A，Aba)、Yeast Marker Yeast Transformation system 2、Yeast Protein Extraction Reagent酵母總蛋白提取試劑盒，均購自TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自北京天根生化科技有限公司；c-Myc單克隆抗體，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit質(zhì)粒提取試劑盒、E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit膠回收試劑盒，均購自O(shè)mega公司；NcoI、BamH I限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase連接酶、Kanamycin，均購自Solarbio公司。

2 方法

2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)篩選出的CR1-like序列CCP36和CCP811片段，使用在線軟件Prime Premier 5設(shè)計引物，在上游引物和下游引物分別增加限制性內(nèi)切酶BamH I和NcoI位點(diǎn)。送往北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。序列見表1。

表1 本試驗(yàn)所用引物序列

2.2 基因的擴(kuò)增 以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的CCP36和CCP811質(zhì)粒為模板，利用合成的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為20 μL：Master Mix 10 μL，模板質(zhì)粒1 μL，上、下游引物各0.8 μL，RNase Free H2O 7.4 μL。

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，CCP36 66.6 ℃退火1 min,40個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min(CCP811退火溫度為63.1 ℃)。將PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，電壓75 V電泳60 min，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，切下符合預(yù)期大小DNA片段進(jìn)行膠回收和純化，獲得目的基因。

2.3 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like36及pGBKT7-CR1-like811的構(gòu)建 將電泳鑒定正確且純化后的PCR產(chǎn)物與載體pGBKT7用NcoI和BamH I雙酶切，建立20 μL雙酶切體系：NcoI 1 μL，BamH I 1 μL，10×H Buffer 2 μL，PCR產(chǎn)物與載體pGBKT7各1 μg，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。37 ℃反應(yīng)3 h。將反應(yīng)液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察酶切是否成功，將符合預(yù)期大小的目的基因及載體片段進(jìn)行膠回收和純化，獲得酶切后的CR1-like片段與載體pGBKT7。

酶切后進(jìn)行連接，連接體系為10 μL：10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，載體pGBKT7 1 μL，CR1-like片段7 μL。移液槍輕輕混勻后，4 ℃連接12 h，得到pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811重組質(zhì)粒。

將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用pGBKT7卡那霉素(Kana)抗性篩選陽性克隆。挑取單個陽性菌落接種于含有50 μg/mL Kana的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，按照E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit I試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒。使用BamH I和NcoI對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，建立10 μL雙酶切反應(yīng)體系。37 ℃酶切反應(yīng)3 h。1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。將經(jīng)過酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送往美吉生物公司進(jìn)行測序，將鑒定結(jié)果正確的重組質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)并保存，以備后用。

2.4 誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold 根據(jù)Clontech酵母手冊，采用醋酸鋰法制備感受態(tài)酵母菌Y2HGold。使用Clontech公司的Yeastmaker Yeast Transformation System 2試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，分別將pGBKT7空載體和重組質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞。取200 μL菌液涂布于含有50 μg/mL Kana的SD/-Trp選擇性培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)4 d，直至白色且大小均勻的克隆菌落出現(xiàn)。同時將pGBKT7-53+pGADT7-T陽性對照和pGBKT7-Lam+pGADT7-T陰性對照共轉(zhuǎn)化酵母菌，將菌液涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/Aba平板上共同培養(yǎng)。

2.5 融合蛋白在酵母菌中的表達(dá) 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母菌后，挑取單菌落于5 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。按照Yeast Protein Extraction Reagent試劑盒說明書提取酵母總蛋白，進(jìn)行Western Blot檢測，使用一抗為c-Myc單克隆抗體。

2.6 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like的毒性檢測 轉(zhuǎn)化pGBKT7-CR1-like和pGBKT7空質(zhì)粒于 Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞后，分別挑取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子于5 mL SD/-Trp中培養(yǎng)。30 ℃，24 h，250 r/min。各取100 μL菌液，以0.9% NaCl進(jìn)行1∶10 000稀釋，涂布于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)4 d，觀察菌落生長情況、對比菌落大小及菌落數(shù)量。

2.7 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like的自激活檢測 將包含pGBKT7-CR1-like的菌液1∶10 000稀釋后涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/Aba平板上，30 ℃培養(yǎng)4 d，觀察菌落生長情況及菌落顏色變化。同時對比陽性組和陰性組菌落生長情況。判定標(biāo)準(zhǔn)：陽性組在SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/Aba上均生長，且在SD/-Trp/X-a-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/Aba上菌落呈藍(lán)色；陰性組在SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal上生長，菌落為白色，在SD/-Trp/X-α-Gal/Aba上不生長。

3 結(jié)果

3.1CCP36和CCP811基因擴(kuò)增結(jié)果 以CCP36和CCP811質(zhì)粒為載體，以36 F、36 R和811 F、811 R為引物進(jìn)行擴(kuò)增，CCP36的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，可在500 bp處觀察到清晰條帶，符合預(yù)期結(jié)果518 bp；CCP811可在700 bp處觀察到清晰條帶，符合預(yù)期結(jié)果738 bp(圖1)。

圖1 CR1-like基因PCR擴(kuò)增電泳圖

3.2 重組質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811酶切鑒定 將轉(zhuǎn)入連接產(chǎn)物的DH5α陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，使用BamH I和NcoI對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，如圖2得到518 bp和738 bp左右的條帶，與預(yù)期插入條帶一致，公司測序結(jié)果表明插入片段正確。

圖2 重組質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811的雙酶切鑒定

3.3 融合蛋白的表達(dá)結(jié)果 發(fā)光液顯色后，在50kDa和64kDa之間出現(xiàn)清晰條帶。重組質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811在酵母細(xì)胞中成功表達(dá)蛋白。

圖3 融合蛋白的Western Blot檢測

3.4 誘餌質(zhì)粒的毒性檢驗(yàn) 將pGBKT7-CR1-Like36、pGBKT7-CR1-like811和pGBKT7分別轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)后，分別涂布于SD/-Trp營養(yǎng)缺陷型平板上,30 ℃培養(yǎng)4 d，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒菌落大小和菌落數(shù)量無明顯差異(圖4)，該pGBKT7-CR1-Like36和pGBKT7-CR1-like811誘餌質(zhì)粒不影響酵母細(xì)胞的生長，對Y2HGold酵母細(xì)胞無毒性作用。

圖4 誘餌質(zhì)粒的毒性檢測

3.5 誘餌質(zhì)粒的自激活檢測 將pGBKT7-CR1-Like36、pGBKT7-CR1-Like811轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)后，分別涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/Aba營養(yǎng)缺陷型平板，在SD/-Trp平板上長出白色菌落(圖5A和5D)，在SD/-Trp/X-α-Gal平板上菌落不變藍(lán)(圖5B和5E)，在SD/-Trp/X-α-Gal/Aba營養(yǎng)缺陷型平板上無菌落長出(圖5C和5F)。說明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CR1-Like36和pGBKT7-CR1-Like811表達(dá)的蛋白不具有自激活性，所構(gòu)建重組質(zhì)?？捎糜诤罄m(xù)試驗(yàn)。

圖5 誘餌質(zhì)粒的自激活檢測

如封二彩版圖6所示，陽性對照組在3個培養(yǎng)基上均生長，且在SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/Aba培養(yǎng)基上菌落呈藍(lán)色(封二彩版圖6B和6C)；陰性組只在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal上生長，在SD/-Trp/X-α-Gal/Aba上不生長(封二彩版圖6F)。

4 討論

紅細(xì)胞免疫粘附功能的變化與機(jī)體疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及其免疫狀態(tài)有高度的相關(guān)性[9]。研究證實(shí)，在阿爾茨海默氏疾病[10]、自身免疫性疾病[11]和炎癥[12]等疾病中CR1均發(fā)揮著重要作用。CR1是補(bǔ)體C3b、C4b的主要補(bǔ)體受體，表達(dá)于多種細(xì)胞表面，是一種多態(tài)性膜糖蛋白。CR1也是補(bǔ)體活化的調(diào)節(jié)劑，可以輔助因子I將C3b降解使其失去致炎性，抑制補(bǔ)體的過度活化[13]。紅細(xì)胞CR1介導(dǎo)的免疫粘附功能對評價機(jī)體天然免疫功能狀態(tài)具有十分重要的意義。在畜牧獸醫(yī)臨床應(yīng)用中，監(jiān)測動物紅細(xì)胞的免疫功能對判定動物健康狀態(tài)、疾病的發(fā)生、治療效果、轉(zhuǎn)歸等方面具有重要的診斷應(yīng)用價值。在疾病防控方面，可以通過調(diào)控豬紅細(xì)胞免疫粘附的靶點(diǎn)提高機(jī)體紅細(xì)胞免疫功能，增強(qiáng)豬對繁殖與呼吸綜合征(PRRS)、圓環(huán)病毒病(PCVD)等免疫抑制性疾病的抗病能力。然而在前期的研究中，尚未對豬發(fā)揮免疫粘附功能的分子基礎(chǔ)進(jìn)行研究，為了進(jìn)一步了解豬紅細(xì)胞免疫粘附的分子機(jī)制，本試驗(yàn)利用酵母雙雜交技術(shù)構(gòu)建了豬CR1-like蛋白酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒，檢測其毒性作用和自激活作用，鑒定是否符合酵母雙雜交系統(tǒng)的要求。

酵母雙雜交技術(shù)是檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用的一種有效的分子生物學(xué)方法，由Fields和Song等在1989年提出[14]，是基于對酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)的研究。試驗(yàn)中為了避免結(jié)果的假陽性，對酵母雙雜交誘餌載體進(jìn)行自激活檢測，確保其自身不會激活轉(zhuǎn)錄因子。并且檢測了重組質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白是否對酵母細(xì)胞有毒性而影響蛋白間的相互作用造成假陰性結(jié)果。本試驗(yàn)利用酵母雙雜交技術(shù)，構(gòu)建了豬CR1-like蛋白的酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-CR1-Like36和pGBKT7-CR1-Like811，利用pGBKT7載體自身能合成色氨酸的特點(diǎn)進(jìn)行篩選，結(jié)果誘餌載體轉(zhuǎn)入酵母菌后在缺乏Trp的培養(yǎng)基上生長出白色菌落，說明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。并且通過提取酵母總蛋白，檢測到融合蛋白在酵母細(xì)胞中的表達(dá)。對比轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的酵母菌落，含有重組質(zhì)粒的酵母菌落生長大小無差別，菌落數(shù)量相近，說明融合蛋白對酵母細(xì)胞無毒性作用，不影響酵母菌的正常生長。酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4激活后，報告因子之一的α-半乳糖苷酶被酵母細(xì)胞表達(dá)分泌，在顯色底物X-a-Gal的存在下表現(xiàn)為藍(lán)色，激活后的酵母細(xì)胞同時也表達(dá)報告因子AUR1-C，表現(xiàn)出強(qiáng)的抗Aba性。含有重組質(zhì)粒的酵母菌落在含有X-α-Gal的培養(yǎng)基上生長未變藍(lán)，在添加Aba的培養(yǎng)基中無菌落生長，說明融合蛋白不會單獨(dú)激活酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄啟動子，所構(gòu)建的質(zhì)粒無自激活性。綜上所述，本試驗(yàn)構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811對Y2HGold酵母細(xì)胞無毒性作用，也無自激活現(xiàn)象，符合酵母雙雜交系統(tǒng)的要求，為進(jìn)一步研究豬紅細(xì)胞的免疫功能及其分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。