程 凡 ，張溫清，李 賽，陳官婷，周慧佳，俞東陽(yáng)，郭志忠，周 萍

（1.安徽宣酒集團(tuán)股份有限公司科研中心，安徽宣城 242000；2.江南小窖釀造工藝研究所，安徽宣城 242000）

靜態(tài)頂空技術(shù)（SHS）是色譜分析揮發(fā)性成分和半揮發(fā)性成分特有的進(jìn)樣方法[1]，其免除了繁雜的樣品前處理過程，具有操作簡(jiǎn)單、花費(fèi)少、易于自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛運(yùn)用于釀造、食品、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等行業(yè)[1-7]。

白酒發(fā)酵是自然接種、多菌種參與、開放式、長(zhǎng)周期的固態(tài)發(fā)酵。控制發(fā)酵的前置條件，如淀粉、水分、酸度、溫度等，對(duì)維持發(fā)酵啟動(dòng)微生物菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、后續(xù)發(fā)酵過程微生物演替、代謝物質(zhì)的形成、風(fēng)味物質(zhì)的轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。但一旦進(jìn)入窖池進(jìn)行酒精發(fā)酵，只能通過監(jiān)控發(fā)酵過程中相關(guān)指標(biāo)，來了解、掌握整個(gè)發(fā)酵的狀態(tài)。酒醅中的乙醇含量作為眾多監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一[8]，其檢測(cè)方法依然以傳統(tǒng)蒸餾法為主[9]。近年來，氣相色譜法、質(zhì)譜法、頂空進(jìn)樣等以及結(jié)合其他檢測(cè)方法的普遍使用，為酒醅中乙醇等揮發(fā)性成分的檢測(cè)分析提供了簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確的新方法[9-15]，對(duì)指導(dǎo)白酒釀造生產(chǎn)具有很重要的意義。

本研究利用靜態(tài)頂空進(jìn)樣技術(shù)結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，建立一種內(nèi)標(biāo)法測(cè)定白酒酒醅中乙醇含量的方法，為白酒釀造過程中乙醇指標(biāo)監(jiān)控提供新的檢測(cè)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：白酒酒醅，由安徽宣酒集團(tuán)股份有限公司提供。

試劑：無水乙醇（分析純，99.7%），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；叔戊醇（≥99.5%），購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑為分析純，均購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：7697A 型靜態(tài)頂空進(jìn)樣器，美國(guó)Agilent 公司；GC 7890B-MS 5977A 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；Aquapro 2S超純水機(jī)，美國(guó)艾科浦國(guó)際有限公司；ME204E/02 電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

以無水乙醇為標(biāo)準(zhǔn)品與蒸煮后冷卻的超純水配制0.5%vol、1.0%vol、1.5%vol、2.0%vol、2.5%vol、3.0 %vol 的乙醇系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；叔戊醇為內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)濃度為5 mL/L。

1.2.2 樣品預(yù)處理

稱取2 g 白酒酒醅樣品于20 mL 頂空瓶中，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液和2 mL 經(jīng)蒸煮后冷卻的超純水，漩渦振蕩1 min 后置于靜態(tài)頂空進(jìn)樣器中，待分析。

1.2.3 儀器分析條件

頂空進(jìn)樣器條件：孵育溫度45 ℃，孵育時(shí)間2 min，頂空進(jìn)樣時(shí)間0.5 min。

氣相色譜分析條件：色譜柱：VF-WAX ms（30 m×250 μm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：160 ℃；載氣為He（≥99.999%），分流比為100∶1，流速為1.0 mL/min；程序升溫條件：40 ℃保持不變2 min，20 ℃/min 至160 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜分析條件：EI離子源，電子能量為70.0 eV，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃。離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式，目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)物定性離子、定量離子、保留時(shí)間參考表1。

表1 乙醇、叔戊醇的定量離子、定性離子

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品預(yù)處理優(yōu)化

酒醅中的乙醇能夠在頂空瓶?jī)?nèi)部體系中得到充分的浸提，在固、液、氣三相中達(dá)到平衡狀態(tài)至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)將酒醅樣品分別以直接揮發(fā)、蒸餾和浸提3 種預(yù)處理方式進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)，最終確定以浸提法作為該方法的預(yù)處理實(shí)驗(yàn)方案，即樣品中加入一定量經(jīng)蒸煮后冷卻的超純水，漩渦振蕩后待測(cè)。根據(jù)1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法設(shè)定儀器分析條件，對(duì)樣品進(jìn)行GC-MS分析，見圖1。

上述條件下，乙醇得到有效檢出，且色譜峰分離效果好。考慮到固態(tài)樣本不均一性，選擇加一定量的超純水，漩渦振蕩，可使內(nèi)標(biāo)在平衡體系中與樣品充分混合，優(yōu)于直接揮發(fā)。蒸餾法相對(duì)操作復(fù)雜，分析效率較低，故未采用。

2.2 分析方法的評(píng)價(jià)

根據(jù)1.2 所示方法，配制乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，以乙醇峰和內(nèi)標(biāo)峰峰面積的相對(duì)響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，乙醇和內(nèi)標(biāo)物相對(duì)濃度為橫坐標(biāo)，建立內(nèi)標(biāo)法測(cè)定白酒酒醅中乙醇含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，該方法在既定的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.996），檢出限（3 S/N）為0.0027 mL/100mL。相關(guān)參數(shù)見表2。

表2 乙醇定量方法的線性和檢測(cè)限

按照酒醅預(yù)處理方法，于酒醅中分別添加不同濃度水平（0.5 %vol、1.5 %vol、2.5 %vol）的乙醇標(biāo)準(zhǔn)樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。計(jì)算該方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表3。結(jié)果表明，該方法具有較高準(zhǔn)確性和回收率，滿足快速測(cè)定白酒酒醅中乙醇含量的要求。

2.3 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法連續(xù)多次進(jìn)樣結(jié)果分析

頂空進(jìn)樣是揮發(fā)性組分分析特有的進(jìn)樣方式，在外部平衡條件不改變的情況下，每一次進(jìn)樣，固定空間內(nèi)的平衡體系中都伴隨一定量目標(biāo)物的損失；且體系將在每一次進(jìn)樣前重新形成新的平衡狀態(tài)。本研究參考林琳等[9]開發(fā)的HS-GC-MS 測(cè)定酒醅中乙醇含量的試驗(yàn)方法，進(jìn)一步加以優(yōu)化，采用穩(wěn)定性更高的內(nèi)標(biāo)法，消除連續(xù)進(jìn)樣揮發(fā)系數(shù)不一致造成的結(jié)果不穩(wěn)定現(xiàn)象；而且本方法采用SIM采集模式，更加精確，排除了出峰時(shí)間內(nèi)其他物質(zhì)的干擾。采用特征離子定量，分別對(duì)同一樣品連續(xù)6 次采樣分析，比對(duì)內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法的穩(wěn)定性，其結(jié)果如圖2所示。

隨著樣品進(jìn)樣次數(shù)的增加，外標(biāo)法定量結(jié)果呈逐漸減少趨勢(shì)。內(nèi)標(biāo)法定量由于分別測(cè)定目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物特征離子的峰面積及相對(duì)校正因子，很好地解決了頂空重現(xiàn)性差的問題，內(nèi)標(biāo)物與乙醇在體系內(nèi)形成比較穩(wěn)定的平衡關(guān)系，其結(jié)果更加穩(wěn)定準(zhǔn)確，充分顯示了內(nèi)標(biāo)法特征離子定量的優(yōu)越性。

2.4 SHS-GC-MS內(nèi)標(biāo)法與傳統(tǒng)蒸餾法比較分析

實(shí)驗(yàn)采用上述SHS-GC-MS 內(nèi)標(biāo)法與傳統(tǒng)蒸餾法進(jìn)行樣品檢測(cè)對(duì)比分析。據(jù)《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書》中出池酒醅中乙醇含量測(cè)定方法：稱取100 g 酒醅于500 mL 蒸餾燒瓶中，加水200 mL 進(jìn)行蒸餾，得餾出液100 mL，攪拌均勻，采用酒精計(jì)測(cè)定其酒精度，查表?yè)Q算得出20 ℃時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)，單位為“%vol”。

由表4 分析比較可得，SHS-GC-MS 內(nèi)標(biāo)法與傳統(tǒng)蒸餾法相比，其準(zhǔn)確性和靈敏度更優(yōu)。綜合分析，傳統(tǒng)蒸餾法易受溫度、濕度等環(huán)境因素的影響，而SHS-GC-MS 內(nèi)標(biāo)法前處理簡(jiǎn)單，干擾組分少，分析時(shí)間短，檢測(cè)數(shù)值穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠，滿足白酒酒醅中乙醇含量的測(cè)定要求。

3 結(jié)論

采用SHS-GC-MS 建立了內(nèi)標(biāo)法測(cè)定白酒酒醅中乙醇含量的方法，并對(duì)方法預(yù)處理進(jìn)行選擇、分析條件參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，使得該方法具有很好的線性回歸和回收率。與傳統(tǒng)蒸餾法相比，本方法更為安全、快速、準(zhǔn)確；與外標(biāo)法相比，內(nèi)標(biāo)法由于其方法的優(yōu)越性，可實(shí)現(xiàn)多次連續(xù)進(jìn)樣，重現(xiàn)性好，靈敏度高，數(shù)據(jù)更加穩(wěn)定。綜合分析，此法簡(jiǎn)便、快捷、精準(zhǔn)，適用于白酒酒醅中乙醇含量的快速測(cè)定。

表4 SHS-GC-MS內(nèi)標(biāo)法與蒸餾法的比較