王 穎

南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院腫瘤科，廣東 深圳 518000

結(jié)腸癌是一種發(fā)生率很高的惡性腫瘤，在我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)生率要比國(guó)外一些發(fā)達(dá)國(guó)家低，但最近幾年，由于人們不良的飲食和生活習(xí)慣，結(jié)腸癌的發(fā)生率呈逐年上升的勢(shì)頭［1-2］。泛素樣含PHD和環(huán)指域1（UHRF1）在很早之前就已經(jīng)被研究者發(fā)現(xiàn)，其與細(xì)胞的生長(zhǎng)關(guān)系緊密相關(guān)，是一種核蛋白基因，參與細(xì)胞周期、繁殖和凋亡等一系列人體生化反應(yīng)，其可結(jié)合半甲基化DNA、甲基化組蛋白H3K9，之后再結(jié)合DNA生長(zhǎng)點(diǎn)，繼而將DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）引到生長(zhǎng)點(diǎn)對(duì)新生鏈DNA的甲基化過(guò)程進(jìn)行催化，繼而保證甲基化譜式遺傳的精準(zhǔn)度［3-6］。當(dāng)前UHRF1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)相關(guān)性的研究較少，本文研究旨在對(duì)UHRF1蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，分析該種蛋白與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，旨在研究這種蛋白與腫瘤轉(zhuǎn)移情況、浸潤(rùn)深度之間的關(guān)系，指導(dǎo)結(jié)腸癌放化療方案的制定，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 一般資料

1.1 標(biāo)本來(lái)源

使用上海芯超結(jié)腸癌芯片結(jié)腸癌HColA150CS02作為研究對(duì)象，男性44例，女性31例，年齡在26～83歲，平均年齡為（62.37±12.6）歲，根據(jù)美國(guó)聯(lián)合癌癥分類(lèi)委員會(huì)（AJCC）制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：36例在Ⅰ～Ⅱ期，39例在Ⅲ～I(xiàn)V期；11例處于高分化狀態(tài)，47例處于中分化狀態(tài)，17例處于低分化狀態(tài)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

彩色全自動(dòng)圖像分析儀、光學(xué)顯微鏡石蠟切片機(jī)、撈片機(jī)、烤片箱、電磁爐、高壓鍋、冰箱等。

2 方法步驟

2.1 切片

2.1.1 切片前準(zhǔn)備：用洗滌液先將載玻片、蓋玻片清洗干凈并烘干，之后將載玻片、蓋破片分別置于濃硫酸中8～12 h、6 h，將兩種破片取出后用自來(lái)水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗干凈，之后將兩種玻片泡于95%的乙醇中，第二天將其取出烘干，放置在盒中備用。為了防止免疫組織染色時(shí)切片脫片，在貼片之前，用玻片硅化試劑涂于載玻片上，烘干備用。

2.1.2 石蠟切片制備：用石蠟切片機(jī)切片，每片標(biāo)準(zhǔn)厚度為4μm，使用載玻片將切片撈出，置于切片架上，為了防止脫片，將切片放置在溫度為人體正常體溫的箱內(nèi)，第二天再取出。

2.2 免疫組織染色

（1）將切片放入烤片機(jī)中進(jìn)行高溫烘烤，時(shí)間為10～60 min，直至切片上的石蠟被全部烘干。試劑：鼠抗人UHRFl單克隆抗體（1:150稀釋?zhuān)?gòu)自美國(guó)Abcam公司）；通用免疫組織化學(xué)SP試劑盒和DAB顯色試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。（2）按下述順序沖洗：用二甲苯I、二甲苯II各沖洗15 min，100酒精I(xiàn)、100%酒精I(xiàn)I各沖洗5 min，95%酒精、90%酒精、80%酒精、50%酒精各沖洗5min，PBS溶液沖洗3次，3min/次。（3）用蒸餾水沖洗，清除殘留在切片上的PBS液體，將切片置于高壓鍋中，加入0.1M枸櫞酸鹽緩沖液（酸堿值為6.0），直至溶液完全沒(méi)過(guò)切片，加熱20min左右直至溶液沸騰，自然冷卻10 min左右，之后用PBS每次沖洗切片5 min，共3次。（4）用蒸餾水沖洗，清除殘留在切片上的PBS液體，每張切片滴入大約10μL的一抗（UHRF1、DPD和Ki-67），將切片置于冰箱中，4℃冷藏，次日將切片取出，用PBS溶液每次沖洗5 min，總共沖洗3次。（5）用蒸餾水沖洗，清除殘留在切片上的PBS液體，每張切片滴入40μL HRP標(biāo)記過(guò)的IgG，人體正常體溫下孵育10 min，用PBS沖洗5 min/次，共3次。（6）用蒸餾水沖洗，清除殘留在切片上的PBS液體，每張切片滴入現(xiàn)配制的DAB顯色劑60μL，室溫?zé)o光條件下顯色，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，在合適的時(shí)間用自來(lái)水停止反應(yīng)（此過(guò)程約為2～5 min）。（7）用蘇木精染色，重復(fù)操作60 s，自來(lái)水沖洗，用1%鹽酸酒精分化液將組織過(guò)多結(jié)合的染色劑脫去，1%氨水使蘇木素染上的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，用自來(lái)水沖洗。（8）將切片按順序放于50%濃度酒精、80%濃度酒精、90%濃度酒精、95%濃度酒精中各脫水5 min，用100%酒精I(xiàn)、100%酒精I(xiàn)I各脫水10 min，二甲苯I、二甲苯II各透明10 min，采用中性樹(shù)膠粘合劑進(jìn)行封片。

陰性對(duì)照：用免疫組織染色方法進(jìn)行染色的切片；陽(yáng)性對(duì)照：用已知的結(jié)腸癌陽(yáng)性組織切片。每個(gè)切片同時(shí)設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

2.3 試驗(yàn)結(jié)果判定

由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師在不知情的情況下對(duì)各組染色切片進(jìn)行觀察并判斷。觀察：每個(gè)切片隨機(jī)選擇高倍鏡（×100）下的5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)細(xì)胞數(shù)200個(gè)。判斷：UHRF1大多染色于胞質(zhì)和胞膜，陽(yáng)性染色的細(xì)胞占比為0，則為0分，陽(yáng)性細(xì)胞＞0～25%計(jì)為1分，陽(yáng)性細(xì)胞≥25%～50%計(jì)為2分，陽(yáng)性細(xì)胞≥50%～75%計(jì)為3分，陽(yáng)性細(xì)胞≥75%計(jì)為4分。無(wú)陽(yáng)性染色為0分，呈現(xiàn)淺黃色為1分，在淺黃色與棕黃色間為2分，呈現(xiàn)深黃色為3分。最終分?jǐn)?shù)為上述兩項(xiàng)的乘積，陰性（-）記為0分，弱陽(yáng)（+）記為1～4分，中陽(yáng)（++）記為5～8分，強(qiáng)陽(yáng)（+++）記為9～12分。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，三種蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率為計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)，各指標(biāo)的相關(guān)性分析采用Pearson分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 UHRF1蛋白在結(jié)腸癌組織與正常結(jié)腸組織中的表達(dá)

UHRF1高表達(dá)于胞質(zhì)和胞膜，UHRF1蛋白結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為64.00%（48/75）高于正常結(jié)腸組織中的陽(yáng)性率表達(dá)28.00%（21/75），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.57，P＜0.05）。

3.2 UHRF1蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

UHRF1蛋白結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況均與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度的臨床病理參數(shù)不存在相關(guān)關(guān)系，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與浸潤(rùn)深度、TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，浸潤(rùn)深度與TNM分期呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，UHRF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率會(huì)隨之升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 UHRF1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

4 討論

UHRF1蛋白高表達(dá)于增值分裂的細(xì)胞，但在處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞卻呈現(xiàn)出低表達(dá)狀態(tài)［7-8］。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化的試驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示UHRF1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，UHRF1的表達(dá)與浸潤(rùn)深度、TNM分期呈正相關(guān)關(guān)系，UHRF1在發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中其陽(yáng)性表達(dá)率比未發(fā)生轉(zhuǎn)移的高，證明了UHRF1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。

本文實(shí)驗(yàn)采用免疫組化的方法，分析UHRF1蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)UHRF1蛋白結(jié)腸癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于正常結(jié)腸組織的陽(yáng)性表達(dá)率，UHRF1蛋白結(jié)腸癌組織的表達(dá)情況與浸潤(rùn)深度、TNM分期具有正相關(guān)性，UHRF1蛋白在發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率均高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移者，說(shuō)明UHRF1蛋白與結(jié)腸癌的產(chǎn)生、發(fā)展及預(yù)后息息相關(guān)。綜上所述，UHRF1對(duì)提升結(jié)腸癌患者的臨床診斷敏感度具有一定的價(jià)值，可指導(dǎo)放療、化療方案的制定以及預(yù)后情況的判斷。