李政垚 劉潔穎 趙宇 高鵬 王以朋

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京 100730）

在醫(yī)療器械/材料的評價中，對醫(yī)療器械材料生物相容性的評價是首要的,溶血實驗用來測定醫(yī)用材料對紅細胞的影響有重要價值，直接或間接造成明顯溶血反應的材料應用會受到限制。

目前骨科最常用的內(nèi)置物是螺釘、接骨板等，其主要目的是穩(wěn)定骨的斷端，為骨的愈合創(chuàng)造條件。金屬材料因其有良好的生物相容性、可靠的機械強度、優(yōu)異的斷裂韌性成為醫(yī)用骨科材料的首選，目前常用材料包括不銹鋼、鈦和鈷鉻鉬合金。但這些材料存在以下問題：①長期滯留造成永久性物理刺激、慢性炎癥反應[1]；②緩慢釋放有毒元素[1,2]；③過強的機械性能，與骨骼之間的彈性模量差異造成的“應力遮擋”效應可干擾骨的新陳代謝，從而造成骨丟失，甚至出現(xiàn)繼發(fā)性骨折[3]；④需二次手術(shù)取出，造成患者痛苦及醫(yī)療資源占用。因此可降解植入材料的研發(fā)已經(jīng)成為熱點領域之一。

目前常作為骨科醫(yī)用的可降解金屬材料包括鎂合金、鐵合金及鋅合金等。鎂，由于有良好的生物相容性及可降解性，逐漸成為可降解骨科材料研究的熱點[4,5]。鎂在體內(nèi)主要降解過程如下。

首先水溶液中鎂的腐蝕是一種電化學現(xiàn)象[6]：

Mg+2H2O →Mg(OH)2+H2

接下來如果腐蝕性介質(zhì)中含有濃度高于30 mmol/L的氯化物，則發(fā)生如下反應[7]:

Mg(OH)2+2Cl-→MgCl2+2(OH)-

實際上其在體內(nèi)降解過程更加復雜，體液中存在鈣離子、磷酸根離子、碳酸根離子、蛋白質(zhì)、細胞、微生物等都共同參與其降解的過程[8,9]。

我國的現(xiàn)行國家標準GB/T 16886[10]列出了溶血實驗總則，但并未給出實驗過程及選擇實驗方法的原則。在具體實施該實驗時，研究機構(gòu)都會選用GB/T 16175-2008《醫(yī)用有機硅材料生物學評價實驗方法》[11]中的溶血實驗方法。但有報道發(fā)現(xiàn)按照如上方法進行直接接觸法溶血實驗時，多種鎂合金體現(xiàn)出較強的導致溶血的作用[12-18]。為進一步探求鎂及鎂合金的生物相容性，本研究對純鎂及3種鎂合金進行溶血實驗（直接接觸法）和改良實驗進行評價，并根據(jù)結(jié)果對現(xiàn)行醫(yī)用材料溶血評價標準進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

生理鹽水（normal saline,NS）（安徽，雙鶴），DPBS緩沖液（北京，四環(huán)陽生），超純水機（美國，Aquapro 公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（美國，Thermo 公司），ICP-AES 分析儀（日本，島津公司），pH 計（意大利，HANNA公司）。

1.2 樣品的制備

按照GB/T 16886原則，采用GB/T 16175-2008的實驗方法，按照材料重量/溶液容積5 g/10 ml的比例，將純鎂Mg9999（99.99%Mg，河南宇航金屬材料有限公司）、鎂合金B(yǎng)M ZG 20（Mg-2.5%Zn-0.05%Ca，西安卓恰醫(yī)療器械有限公司），鎂合金AZ31B（Mg-2.5-3.5%Al-0.6-1.4%Zn-0.2-1%Mn，營口銀河金屬材料有限公司），鎂合金WE43（Mg-3.85%Y-0.48%Zr-2.14%Nd，貴州安吉有色鑄造有限公司）在相應容積的NS中制備，于恒溫水浴中37℃±1℃保溫30 min，平行制備3管。以相同重量/溶液容積比例將上述材料使用D-PBS緩沖液同法制備樣品。同法恒溫水浴分別制備3 管同體積NS、D-PBS 緩沖液作為陰性對照組，3管注射用水作為陽性對照組。

分別抽取3只新西蘭大白兔外周血混合，收集于含草酸鹽的抗凝試管中，取8 ml兔血與10 ml NS充分稀釋。

1.3 溶血實驗（直接接觸法）

全部試管放入恒溫水浴37℃±1℃保溫30 min后，按照0.2 ml稀釋兔血/10 ml實驗液的比例，每只試管加入稀釋兔血，輕輕混勻，置37℃±1℃水浴中繼續(xù)孵育60 min，倒出管內(nèi)液體，500 g離心5 min。吸取100 μl上清液移入96 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，于540 nm 波長處測定吸光度（optical density,OD）值。

1.4 溶血率計算

使用以下公式計算溶血率：溶血率（hemolysis rate,HR）=[(實驗組OD 值-陰性對照組OD 值)/(陽性對照組OD值-陰性對照組OD值)]×100%

按照本實驗檢驗醫(yī)療器械時，合格的判定指標一般規(guī)定為溶血率＜5%。

1.5 上清液鎂離子濃度分析及pH值測定

使用pH 計測定各試管內(nèi)液體pH 值。收集剩余各試管內(nèi)上清液，4℃冷藏保存，24 h 內(nèi)送檢，使用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy,ICP-AES）儀分析上清液鎂離子濃度。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。所獲數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。溶血實驗同一材料組內(nèi)比較以及各組間比較采用獨立樣本t檢驗，使用Bonferroni校正法校正。數(shù)據(jù)間的相關(guān)性以Spearman相關(guān)系數(shù)進行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組溶血率

各組溶血實驗結(jié)果如圖1 所示，4 種材料使用2種測試介質(zhì)共8組，實驗組上清液在540 nm處OD值均高于陰性對照組，提示各實驗組均發(fā)生溶血現(xiàn)象。

如圖2所示，在同一材料組中，NS作為實驗介質(zhì)時OD值顯著高于D-PBS緩沖液組。

各組溶血率如表1所示，所測定的4種鎂基金屬材料中，使用NS作為測定介質(zhì)時，各組都體現(xiàn)出了較高的溶血率，溶血率最低的BM ZG 20 鎂合金組也達到34.0%±2.7%，最高的AZ31B 組可達到75.5%±4.4%。而當使用D-PBS 緩沖液作為測定介質(zhì)時，各組溶血率出現(xiàn)顯著下降，僅BM ZG 20 組最高達到5.3%±3.5%，其余組均低于5%。同一材料使用不同介質(zhì)時出現(xiàn)的差異均有統(tǒng)計學意義。

2.2 各組鎂離子濃度

各組實驗后上清液鎂離子濃度如表2所示，由于NS 及D-PBS 2 種介質(zhì)均不含鎂離子，上清液中鎂離子總量應為材料在溶液中降解產(chǎn)生的鎂離子與紅細胞破裂后少量鎂離子之和。鎂離子含量最高的為AZ31B-NS 組，濃度為（40.17±0.49）mg/L，其他以NS為實驗介質(zhì)的組則鎂離子含量比較接近，約20 mg/L左右。而以D-PBS 為介質(zhì)的組中，鎂離子含量最高的是AZ31B-DPBS組，濃度為(20.98±0.49)mg/L，最低為BM ZG 20-DPBS 組，濃度為(14.69±0.37)mg/L。同種材料來看，D-PBS 緩沖液作為測試介質(zhì)上清液鎂離子含量均低于NS組，且差異均有統(tǒng)計學意義。

2.3 各組上清液pH值

如表2所示，4種金屬材料采用NS作為測試介質(zhì)時，溶液pH 值上升更明顯，均在10～11 之間，其中pH 值上升最明顯為AZ31B-NS 組為10.7±0.1，pH 值上升最少的BM ZG 20-NS組也達到10.1±0.2。以DPBS 緩沖液為測試介質(zhì)時，pH 值上升最明顯為AZ31B-DPBS 組，也僅為9.1±0.3。同種材料組內(nèi)來看，D-PBS 緩沖液作為測試介質(zhì)上清液pH 值均低于NS組，且差異均具有統(tǒng)計學意義。

2.4 溶血率與鎂離子濃度、pH值相關(guān)性分析

圖1 不同介質(zhì)組溶血實驗后上清液在540 nm處OD值

圖2 不同材料組溶血實驗后上清液在540 nm處OD值

以2種不同測試介質(zhì)對實驗組分組，各組溶血率與鎂離子濃度及pH 值相關(guān)性分析如表3 所示。以NS 為測試介質(zhì)時，溶血率與樣品上清液pH 值、鎂離子濃度均體現(xiàn)出了顯著正相關(guān)性，而D-PBS 緩沖液作為測試介質(zhì)時，溶血率則不與上述因素相關(guān)。

3 討論

參考我國公認的評價標準，本研究采用的實驗方法主要參考GB/T 16175-2008《醫(yī)用有機硅材料生物學評價實驗方法》中的溶血實驗（直接接觸法）方法，這也是目前在骨科醫(yī)療器械評價中的最常用到的實驗方法，傳統(tǒng)金屬材料常規(guī)也按照此法進行評價。在此實驗方法的基礎上，為適當減少實驗過程中pH值急驟上升的現(xiàn)象，我們擬將評價介質(zhì)由NS更換為一種緩沖液進行平行實驗作為另一研究組?，F(xiàn)行3種主要國際標準中，D-PBS緩沖液被美國材料與試驗協(xié)會（American Society for Testing and Materials,ASTM）[19]選用，與D-PBS 緩沖液相比，PBS 緩沖液中含有鎂離子和鈣離子，可能鎂離子會造成對溶血實驗過程中產(chǎn)生的鎂離子量評價不準確，同時有鈣離子存在時，可能會和磷酸根一起參與和氫氧化鎂的反應在材料表面生成磷酸-鎂-鈣鹽保護層，造成對實驗的干擾。HANKS 液和模擬體液(simulated body fluid,SBF)中同樣含鈣、鎂離子，同時成分更加復雜，其中含有硫酸根、葡萄糖等，SBF中還含有碳酸根，可能和實驗中的鎂離子等發(fā)生反應形成沉淀造成干擾。而MEM 培養(yǎng)基同樣含有鈣、鎂離子、碳酸氫根、碳酸根、硫酸根等可能影響實驗結(jié)果的物質(zhì)，同時還包含很多營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、葡萄糖等，對于可降解材料的評價來說干擾因素過多，不適合作為一種“評價標準”使用的測試介質(zhì)。所以綜上來看，本研究選取了D-PBS緩沖液作為測試介質(zhì)。

本實驗結(jié)果提示，鎂及鎂合金在NS 作為測試介質(zhì)時對兔血起到了很強的溶血效應，溶血率34.0%～75.5%不等，如果按照此測試方法的結(jié)果，鎂及鎂合金材料作為一種體內(nèi)置入的醫(yī)療器械顯然是不妥的。但是，當我們將測試介質(zhì)更換為D-PBS 緩沖液時，各實驗材料的溶血效應大幅度降低，僅有BM ZG 20組溶血率略微超過5%，其他組均在5%以下，符合醫(yī)療器械生物相容性的標準。

表1 各實驗組溶血率（±s，%）

表1 各實驗組溶血率（±s，%）

注：與同材料NS組比較，△P＜0.0025

表2 各實驗組鎂離子濃度測定及pH值（±s）

表2 各實驗組鎂離子濃度測定及pH值（±s）

注：與同材料NS組相比，△P＜0.0025

當使用2種不同的測試介質(zhì)時，測試的結(jié)果產(chǎn)生了巨大的差異，那么造成這種差異的原因是什么？從本實驗結(jié)果看，鎂及鎂合金作為一種可降解材料，在2種溶液中均發(fā)生了降解，主要降解產(chǎn)物即鎂離子和OH-，造成了溶液pH值的升高。而所有材料在NS中的降解造成的鎂離子和pH 值升高都較D-PBS 緩沖液中更顯著，其中以pH值升高更為明顯，這可能是D-PBS 緩沖液對酸堿度的緩沖效果造成的。而鎂離子濃度方面，D-PBS 組鎂離子濃度更低可能存在以下2 個原因：D-PBS 緩沖液中含有少量磷酸根（8.1 mmol/L）和磷酸二氫根（1.1 mmol/L），其可能和溶液中降解生成的游離鎂離子結(jié)合形成磷酸-鎂鹽沉淀降低鎂離子濃度；同時磷酸根可能直接和鎂/鎂合金表面與H2O 反應生成的氫氧化鎂直接反應形成表面沉積的磷酸-鎂鹽保護層，這則有可能影響到溶血實驗的結(jié)果。但是由于D-PBS緩沖液中的氯離子濃度（137 mmol/L）遠高于磷酸根和磷酸二氫根的濃度，其和材料表面的氫氧化鎂反應更活躍，所以形成材料表面磷酸-鎂鹽保護層的量較小，對實驗結(jié)果的影響有限。結(jié)合本研究中的相關(guān)性分析來看，在NS組，材料溶血率顯著與pH 值和鎂離子濃度正相關(guān)，且相關(guān)性很強，溶血可能是和以上2個因素相關(guān)。通過進一步計算，所有測試組的鎂離子濃度測定結(jié)果在0.61～1.67 mmol/L之間，與哺乳動物血清中0.8～1.2 mmol/L正常值接近，且在D-PBS緩沖液組中，高鎂離子環(huán)境下也未出現(xiàn)明確溶血。Zhen 等[20]的研究采用了和本研究相同的樣本處理和實驗方法，對純鎂進行溶血性的研究，分別采用NS和PBS緩沖液作為測試介質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在PBS緩沖液組，溶血率顯著下降，溶液中鎂離子濃度上升和pH值上升都較NS組更緩和，這與我們的研究結(jié)果相符合。同時該研究配置了不同濃度高鎂離子和不同pH值的NS溶液進行溶血實驗，發(fā)現(xiàn)高鎂離子不會造成溶血率大幅上升，但是當pH值高于10時，溶血率會出現(xiàn)大幅上升。該研究同時使用不同濃度高鎂離子培養(yǎng)基和不同pH值的堿性培養(yǎng)基對L929細胞系進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在pH值高于11時細胞生存率陡然下降。該研究認為，純鎂降解過程中造成的實驗溶液pH上升可能是造成溶血率上升的主要原因。綜上分析，考慮使用NS作為測試介質(zhì)時，pH值的大幅升高與溶血效應的正相關(guān)性更值得關(guān)注。

表3 Spearman分析各實驗組溶血率與鎂離子濃度及PH值相關(guān)性(r值)

直接接觸法溶血實驗的目的，主要是驗證當紅細胞直接接觸材料時是否會發(fā)生溶血反應造成嚴重的副作用。但依據(jù)上述實驗方法對鎂及鎂合金進行檢驗時，卻因為溶液pH顯著增高造成了溶血反應，而利用緩沖液測試時，紅細胞的直接接觸反而沒有出現(xiàn)明顯的溶血反應。但顯然在人體內(nèi)，體液不斷流動、交換，同時體液內(nèi)存在緩沖系統(tǒng)，并且鎂及鎂合金材料表面在體內(nèi)會形成更復雜的化合物保護層，以上這種內(nèi)植物區(qū)域局部pH值增加的效應在體內(nèi)相對在NS溶液中會更加緩和，這種使用NS作為測試介質(zhì)的實驗方式會誤導我們對這種可降解醫(yī)用材料生物相容性的判斷，另一對鎂合金溶血實驗進行研究的學者也持有相同看法[12]。所以最近已經(jīng)有學者[21]開始使用緩沖液作為可降解材料溶血實驗的測試介質(zhì)，發(fā)現(xiàn)這種情況下鎂合金溶血率很低，但是這種方式暫時還不具備檢驗標準的法律支持。在材料的研發(fā)中，很多研究[22,23]通過各種方式如表面覆膜來降低材料的降解速度，進而在此評價標準下改善溶血實驗的結(jié)果。這不僅將材料復雜化，而真正應用時覆膜降解后紅細胞直接接觸的仍是鎂合金表面，這無疑與我們評價標準的設立目的是相悖的。并且在現(xiàn)有標準的指導下，一些研究[17,24-26]會得出單純鎂合金在生物相容性方面明顯較經(jīng)表面處理過的鎂合金差的結(jié)論，這種結(jié)論可能與事實不完全相符，這顯然有可能增加對醫(yī)用材料研發(fā)的成本。

我國目前用于驗證材料生物相容性的現(xiàn)行國家標準GB/T 16886.4[10]主要參考的即為國際性標準ISO 10993.4[27]，但是ISO 10993.4 標準列出了溶血實驗總則，但并未給出實驗過程及選擇實驗方法的原則。在具體實施時，傳統(tǒng)的溶血實驗方法為按照GB/T 16175-2008《醫(yī)用有機硅材料生物學評價實驗方法》進行，即本實驗采用的溶血實驗評價方法。目前世界上公認的、廣泛采用的評價醫(yī)療器械和醫(yī)用材料溶血性的方法主要包括以下3 種：國家健康機構(gòu)（National Institutes of Health,NIH）法[28]、ASTM F756[19]和日本衛(wèi)生勞動及福利部（Ministry of Health,Labour and Welfare,MHLW）[29]方法。3種測試方法的主要異同如表4所示。

結(jié)合上述標準來看，我國目前檢測及評價機構(gòu)采用的測定方法，基本為參考NIH 法形成，與之相比略有微調(diào)，如陽性對照組采用注射用水，這種方法已經(jīng)有研究證實是有效的[30,31]。3 種測試方法在樣品-測試介質(zhì)-血液的比例和接觸時間上略有不同，對血液制備的要求和血源要求上也有所不同，但是在方法上都被證明可行性、可重復性好。最終溶血率的評價和計算上，原理也比較相似。但在這3種評價標準中，只有ASTM標準采用了D-PBS緩沖液作為測試介質(zhì)，考慮到了pH值對溶血實驗測定結(jié)果的影響，更符合人體內(nèi)情況，而其他2 種方案仍采用的為NS 作為測試介質(zhì)，這也是本次實驗選取D-PBS 緩沖液作為改進方法的重要依據(jù)之一。使用NS作為測試介質(zhì)是有歷史原因的：其較容易獲得，與血細胞組織相容性好。而在鎂合金、鐵合金、鋅合金等可降解醫(yī)用金屬材料廣泛進入視野之前，醫(yī)用材料主要以耐腐蝕性較好的金屬材料，如鈦合金、不銹鋼，和非金屬材料，如有機硅材料為主，這些材料通過短時間的浸提和反應對測試介質(zhì)液體離子濃度和pH值都不會造成比較大的影響，所以NS一直被作為標準的測試介質(zhì)。

目前醫(yī)療“微創(chuàng)化”和“舒適化”需求不斷提高，可降解材料將會更多出現(xiàn)在我們視野中，在降解過程中會引起pH 值改變的材料也會陸續(xù)出現(xiàn)，繼續(xù)采用現(xiàn)行標準對此類材料進行評價顯然是不合適的。所以對當前ISO10993.4標準及我國采取的GB/T16886.4標準中的溶血實驗方法進行進一步明確和完善，綜合考慮其降解過程中產(chǎn)生的其他影響，制定合適的測試方法盡量排除干擾因素，是接下來十分有意義的工作。

表4 三種溶血實驗方法比較