樊春紅，陳曉寧

(北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100044)

心血管疾病是人類健康的巨大威脅，特別在老年患者中，各種原因?qū)е碌男募≈厮茏罱K均可轉(zhuǎn)變?yōu)樾牧λソ摺６?dāng)心力衰竭出現(xiàn)后，其病死率顯著增加。然而，由于缺乏較好的心力衰竭預(yù)測(cè)指標(biāo)，常不能在心衰發(fā)生前采取有效的干預(yù)措施。因此，發(fā)現(xiàn)新的心衰預(yù)測(cè)標(biāo)志物，對(duì)于預(yù)防心力衰竭的發(fā)生有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類有調(diào)控作用的非編碼RNA，通常有21～23個(gè)核苷酸組成。它們通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)結(jié)合而發(fā)揮其負(fù)性調(diào)控作用。近來研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA參與心肌重塑及心力衰竭的調(diào)控。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-221/222在心肌重塑動(dòng)物模型過程中發(fā)揮著重要作用[1]。然而miR-221/222表達(dá)的調(diào)控及其與人心力衰竭的關(guān)系并不清楚。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)廣泛存在于基因組中。體內(nèi)SNP位點(diǎn)的變異在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療過程中有重要的調(diào)控作用。因此，某些有關(guān)鍵功能基因的SNP位點(diǎn)常用于相應(yīng)疾病的檢測(cè)及用藥指導(dǎo)[2,3]。SNP對(duì)于miRNA的功能也有重要影響。一方面，miRNA自身編碼基因出現(xiàn)的SNP可影響其剪切及結(jié)合；另一方面，發(fā)生在靶基因結(jié)合位點(diǎn)的SNP也可影響其結(jié)合作用。因此，本研究以miR-221/222為目標(biāo)，分析SNP對(duì)其表達(dá)的影響，并探討與心力衰竭的關(guān)系，旨在發(fā)現(xiàn)新的心衰預(yù)測(cè)指標(biāo)，為本病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象:分別取自2010年至2018年在本院住院且經(jīng)診斷為心力衰竭的男性患者共100例，平均年齡64.2±5.2歲；對(duì)照組為同期體檢的健康男性，經(jīng)年齡匹配后共入組100例，平均年齡59.5±8.7歲，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間年齡無顯著性差異。

1.2樣品采集:所有研究對(duì)象均采用EDTA-K2真空采血管取晨間空腹靜脈血4mL。經(jīng)2500轉(zhuǎn)/分離心后分別分離血細(xì)胞和血漿，均凍存于-80℃冰箱備用。

1.3DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序:采用酚-氯仿-異戊醇法抽提外周血白細(xì)胞，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定合格后，采用NaNo Drop測(cè)定濃度，取部分基因組DNA，并稀釋至50ng/μL用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。采用PCR法對(duì)待測(cè)部分片段進(jìn)行擴(kuò)增，詳細(xì)信息見表1。依據(jù)表1中的信息進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳判斷擴(kuò)增結(jié)果，并將PCR產(chǎn)物采用Sanger法測(cè)序，通過所獲取的測(cè)序圖分別判斷SNP情況。

表1 本研究所采用的的引物序列及條件

1.4血漿miRNA提取及表達(dá)檢測(cè):將血漿樣品從冰箱取出、冰上自然融化。采用mirVana血漿miR提取試劑盒(Life technologies公司)提取血漿miRNA。在提取時(shí)，每個(gè)樣品中均加入線蟲Cel-miR-39類似物作為內(nèi)參一并提取。采用NaNoDrop對(duì)提取的RNA進(jìn)行定量測(cè)定和質(zhì)量鑒定，并將其稀釋至5ng/μL。之后，將提取出的血漿總miRNA采用ABI公司microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將各組樣品中的miR-221、miR-222和Cel-miR-39進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用ABI公司的特異性TaqMan探針Real-time PCR法試劑盒檢測(cè)各樣品中的miR-221、miR-222及Cel-miR-39的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-221及miR-222在各組間的差異。

2 結(jié) 果

2.1miR-221/222基因簇SNP位點(diǎn)在心力衰竭中的分布:為探討miR-221/222基因簇SNP位點(diǎn)于心力衰竭的關(guān)系，我們首先分析了該基因簇的序列特點(diǎn)，篩選出rs2858059、rs2858060、rs2858061、rs113054794和rs34678647共5個(gè)候選SNP位點(diǎn)，經(jīng)測(cè)序結(jié)果見表2。

表2 miR-221/222基因簇SNP位點(diǎn)各基因型在心衰及對(duì)照組中分布(n)

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，上述SNP位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡，其中rs2858059、rs2858060兩個(gè)SNP位點(diǎn)存在顯著連鎖，且它們?cè)趦山M間分布均無差異(P>0.05)。rs113054794位點(diǎn)在所測(cè)的200例研究對(duì)象中僅發(fā)現(xiàn)C/-基因型。rs34678647位點(diǎn)在對(duì)照組中的比例為4%，在心衰組中占10%，兩組間分布無差異(P>0.05)。

2.2miR-221/222靶基因結(jié)合位點(diǎn)SNP在心力衰竭中的分布:p27及DDIT4為miR-221/222的已知靶基因[4,5]，其3'UTR區(qū)的SNP位點(diǎn)很可能影響miR-221/222的結(jié)合而調(diào)控心力衰竭。通過分析其結(jié)合序列發(fā)現(xiàn)，p27基因3'UTR區(qū)的rs182069485(G>T)位點(diǎn)以及DDIT4基因的rs72808106(A>G)位點(diǎn)很可能影響miR-221/222與該區(qū)域結(jié)合。然而，經(jīng)過測(cè)序發(fā)現(xiàn)，位于p27基因的rs182069485在200例研究對(duì)象中全為G/G基因型，位于DDIT4基因的rs72808106在200例研究對(duì)象中全部為A/A基因型，兩者均未檢測(cè)到多態(tài)性。

2.3血漿miR-221/222水平與心力衰竭的關(guān)系:通過real-time PCR分別檢測(cè)心衰患者血漿miR-221及miR-222的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者在心衰患者中均顯著升高(P<0.01)，見圖1。

圖1 miR-221/222在心衰患者血漿中的表達(dá)

2.4miR-221/222基因多態(tài)性對(duì)血漿表達(dá)水平的影響：我們?cè)谛乃セ颊咧?，分別按照rs2858061、rs2858060(因與rs2858059連鎖僅分析其中1個(gè))和rs34678647基因型進(jìn)行分組，觀察血漿miR-221/222的表達(dá)強(qiáng)度。研究發(fā)現(xiàn)，rs2858061、rs2858060兩個(gè)SNP位點(diǎn)按照各基因型分組，其患者血漿miR-221/222均無顯著差異(P>0.05)。按rs34678647位點(diǎn)基因型分組，miR-221表達(dá)在兩組間無顯著差異(P>0.05)，但miR-222的表達(dá)在T/-基因型中顯著高于G/-基因型，其強(qiáng)度分別為3.97(1.19,12.65)和0.75(0.28,3.40)。由此提示，rs34678647位點(diǎn)多態(tài)性很可能與心衰患者血漿miR-222的表達(dá)有關(guān)，見圖2。

圖2 心衰患者miR-221/222基因簇SNP位點(diǎn)對(duì)其表達(dá)的影響

3 討 論

miRNA-221/222是心肌重塑的關(guān)鍵調(diào)控分子。前期研究以轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為模型，分別研究了miR-221及miR-222對(duì)心肌重塑和心力衰竭的調(diào)控作用[1]。但其是否可作為人心力衰竭的預(yù)警標(biāo)志物仍然不清楚。本研究通過SNP聯(lián)合血漿miRNA表達(dá)強(qiáng)度的方法，分析了miR-221/222在心力衰竭中的調(diào)控狀態(tài)，并發(fā)現(xiàn)血漿miR-221及miR-222的表達(dá)均在心衰患者中上調(diào)，且miR-222的表達(dá)可能受該基因簇SNP位點(diǎn)rs34678647調(diào)控。

人類miR-221/222基因簇位于X染色體，miR-221與miR-222編碼基因約相距700bp左右，而其編碼序列并不相同。在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，心肌特異性過表達(dá)miR-221及miR-222后兩者的表型并不完全相同，且miR-222過表達(dá)后心肌重塑及心衰程度更為嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)，心衰患者血漿miR-221及miR-222均升高，提示miR-221/222很可能是心衰新的預(yù)測(cè)分子。

本研究還研究了miR-221/222基因簇的SNP位點(diǎn)在心衰中的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所研究的5個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布在心衰及對(duì)照組中均無差異，表明上述5個(gè)SNP位點(diǎn)可能均不能作為心衰的預(yù)測(cè)位點(diǎn)。但是本研究發(fā)現(xiàn)，rs34678647位點(diǎn)的T基因型可顯著增強(qiáng)miR-222基因的表達(dá)水平，與G基因型相比，其血漿miR-222表達(dá)強(qiáng)度顯著升高。rs34678647位點(diǎn)距離miR-222編碼基因約186bp，而距離miR-221編碼基因約為1022bp。由于該位點(diǎn)距離miR-222基因較近，其很可能通過影響miR-222的生成調(diào)控其在血漿中的表達(dá)水平。然而，要明確該位點(diǎn)對(duì)miR-222表達(dá)的影響，仍需進(jìn)一步通過功能研究加以驗(yàn)證。

p27及DDIT4基因均為miR-221和miR-222的已知靶點(diǎn)[6]，且miR-221/222可通過與其靶基因3'UTR結(jié)合而調(diào)控其表達(dá)。其結(jié)合區(qū)域SNP位點(diǎn)的變異可顯著引起其結(jié)合強(qiáng)度的變化而影響miR-221/222對(duì)心肌重塑和心衰的調(diào)控作用。本研究也檢測(cè)了p27及DDIT4基因的兩個(gè)已知SNP位點(diǎn)，但發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SNP位點(diǎn)在所觀察的研究對(duì)象中均無多態(tài)性。本研究也存在一定的局限性。首先，由于miR-221/222基因簇位于X染色體，本研究僅在男性人群中觀察了相應(yīng)的變化，并不能代表其調(diào)控在女性人群中的作用。其次，部分SNP位點(diǎn)如rs34678647，其T基因型所占比例較少，本結(jié)果仍需在大樣本研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，血漿miR-221/222在心衰男性患者中升高，其可能是新的心衰預(yù)測(cè)指標(biāo)。SNP位點(diǎn)rs34678647可影響心衰患者血漿miR-222的表達(dá)水平，其中T基因型患者血漿miR-222表達(dá)水平顯著上調(diào)，可能為心衰的預(yù)測(cè)提供一定依據(jù)。