干定云，吳 軍，周 曼

(湖北省武漢市第三醫(yī)院/武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院血液內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430061)

多發(fā)性骨髓瘤約占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%，是惡性漿細(xì)胞中常見類型，是漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，世界衛(wèi)生組織將其歸為B細(xì)胞淋巴瘤的一種，其特征是骨髓中漿細(xì)胞克隆性增殖并積聚，其發(fā)病率僅次于白血病[1]。多發(fā)性骨髓瘤患者早期無明顯癥狀，隨著病情的進(jìn)展臨床多表現(xiàn)為骨痛、病理性骨折、貧血和出血、肝脾及腎臟病變等，有部分患者以骨痛為主要癥狀，但較易被誤診而延遲診斷[2]。多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制主要與遺傳、病毒感染、基因突變、骨髓微環(huán)境的相關(guān)作用有關(guān)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和相關(guān)化療藥物的不斷完善，雖可大大延長多發(fā)性骨髓瘤患者的生存期，但該病仍不能治愈[3]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，異常表達(dá)的miRNA分子可作為抑癌基因或促癌基因調(diào)節(jié)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖、遷移[4]。miRNA在體內(nèi)可通過抑制靶基因?qū)蜻M(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，其在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中呈現(xiàn)異常表達(dá)[5]，因此本研究旨在分析miRNA-192-5p對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的診斷效能，并進(jìn)一步分析與患者相關(guān)臨床參數(shù)的關(guān)系，為臨床治療該病提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象：選取2016年5月至2019年5月在我院血液及腫瘤科治療的多發(fā)性骨髓瘤患者90例為骨髓瘤組，其中男54例，女36例，年齡52～75歲，平均(60.21±3.28)歲，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。入組標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液病分會(huì)制定的關(guān)于多發(fā)性骨髓瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②X線檢查有明顯的廣泛性骨質(zhì)疏松和溶骨性損傷；③實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果顯示漿細(xì)胞>30%，且伴有形態(tài)改變；④免疫球蛋白IgG<6.0g/L，IgA<1.0g/L；⑤患者及家屬知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<18歲者；②合并惡性腫瘤者、自身免疫力低下者；③患有心腦血管疾病者；④患有其他血液系統(tǒng)疾病者；⑤合并嚴(yán)重肝腎功能不全者；⑥妊娠及哺乳期婦女。另選取同期來我院行骨質(zhì)疏松檢查但排除多發(fā)性骨髓瘤的患者60例為對(duì)照組，男22例，女38例，年齡50～75歲，平均(59.26±3.16)歲，均排除患有惡性血液病，兩組研究對(duì)象一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與材料：RNA提取試劑購于ThermoFisher Scientific公司；miRNA-192-5p熒光定量PCR試劑盒購于大連TAKARA公司；miRNA-192-5pPCR引物由廣州市銳博公司設(shè)計(jì)合成；乙醇、氯仿購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司；高速離心機(jī)購于美國Beckman Coulter公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法：①提取多發(fā)性骨髓瘤患者血清中總RNA：首先用無酶EP管制備400μL血清樣品，將Trizol LS裂解液1000μL使樣品完全覆蓋，吹氣攪拌均勻，15～25℃的溫度下放置5min。經(jīng)13500轉(zhuǎn)/分的離心力在4℃溫度下離心5min，取上清液置于另一EP管，按照Trizol LS和氯仿5：1的比例將200μL氯仿加入EP管中，用手劇烈搖晃15s后室溫下靜置5min，經(jīng)13500轉(zhuǎn)/分離心力在4℃溫度下離心5min，取上清液置于另一EP管。將異丙醇500μL加入EP管中，倒置離心管2h。再次經(jīng)13500轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速在4℃下離心10min，棄上清液。將預(yù)冷的75%的乙醇1mL加入后輕輕吹氣或倒置離心管，離心后棄去上清液，加入10μL DEPC水溶解，進(jìn)行總RNA濃度檢測，并置于-80℃冰箱保存。②采用熒光定量PCR法檢測血清中miRNA-192-5p的表達(dá)變化：提取血清中總RNA后將總RNA樣品、RT引物工作液及無RNA酶水進(jìn)行混合，然后瞬時(shí)離心，在70℃放置10min，再次加入5μL RT Buffer5×1.25μL RNA酶抑制劑、dNTP mix、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、7.75μL無RNA酶水，在42℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)60min，85℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)5s，RT反應(yīng)結(jié)束后將逆轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物置于冰上冷卻或放-20℃冰箱保存。配制實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系后將溶液充分混合，進(jìn)行瞬時(shí)離心。在PCR板中加入制備好的20μL混合物，并為所有PCR反應(yīng)設(shè)置三個(gè)平行對(duì)照。小心地將密封膜在加液完成后貼在PCR板上，并離心片刻，將PCR板放在冰上或4℃冰箱中，設(shè)定反應(yīng)程序后放入上述PCR板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1兩組研究對(duì)象血清中miRNA-192-5p表達(dá)情況比較：miRNA-192-5p在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中含量為0.72±0.11，在正常對(duì)照組血清中含量為1.08±0.15，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見圖1。

圖1 兩組研究對(duì)象血清中miRNA-192-5p含量比較

2.2ROC曲線分析miRNA-192-5p診斷多發(fā)性骨髓瘤的臨床價(jià)值：ROC曲線分析結(jié)果顯示，miRNA-192-5p診斷多發(fā)性骨髓瘤的曲線下面積為0.653，截?cái)嘀禐?.68，敏感性為77%，特異度為56%，P=0.023。見圖2。

圖2 ROC曲線分析miRNA-192-5p診斷多發(fā)性骨髓瘤的臨床價(jià)值

2.3miRNA-192-5p在多發(fā)性骨髓瘤不同分期相關(guān)參數(shù)的含量比較：miRNA-192-5p的含量在β2-MG含量高的多發(fā)性骨髓瘤患者血清中明顯低于β2-MG含量正常的患者(P<0.05)，miRNA-192-5p的含量在肌酐水平高的患者血清中也明顯低于肌酐水平正常的患者(P<0.05)；miRNA-192-5p的含量在血紅蛋白及白蛋白低下的患者血清中明顯低于血紅蛋白及白蛋白正常的患者(P<0.05)。見表1。

表1 miRNA-192-5p在多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)臨床參數(shù)的含量比較

2.4miRNA-192-5p與多發(fā)性骨髓瘤患者免疫球蛋白的相關(guān)性：多發(fā)性骨髓瘤患者血清中miRNA-192-5p的含量分別與IgG和IgA含量呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.457，-0.615，P<0.05)。見圖3。

圖3 miRNA-192-5p與多發(fā)性骨髓瘤患者免疫球蛋白含量的相關(guān)性

3 討 論

多發(fā)性骨髓瘤是一種來源于免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞的惡性腫瘤，其臨床特點(diǎn)是惡性漿細(xì)胞無限增殖，浸潤骨骼和軟組織釋放免疫球蛋白，導(dǎo)致骨溶解、貧血、腎損害等嚴(yán)重并發(fā)癥，隨著并發(fā)癥的不斷增加，其已成為第二常見的惡性血液病[7-8]。目前多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制尚未清楚，盡管靶向藥物治療已使得多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后得到了顯著改善，但仍不能從根本治愈該病，且現(xiàn)有的預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)不能反映疾病的復(fù)雜性。因此尋找及時(shí)預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、監(jiān)測患者的預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)解決臨床治療問題具有重要意義。近年來有相關(guān)資料顯示，在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病過程中癌基因的異常激活及相關(guān)免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá)起著重要作用[9]。

MiRNA近年來已成為胚胎發(fā)育、腫瘤學(xué)、病毒學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，具有高度的保守性及組織特異性，可通過與mRNA的3“非翻譯區(qū)域的結(jié)合抑制目的mRNA，在體內(nèi)代謝過程中起到多種調(diào)控作用[10]。miRNA小分子可以調(diào)控生物界50%以上的蛋白質(zhì)編碼和翻譯，目前普遍認(rèn)為其與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，miRNA在白血病、淋巴瘤及乳腺癌等非血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可作為抑癌基因或促癌基因起著重要作用。miRNA-192是一種進(jìn)化高度保守的肝臟內(nèi)富集的一類miRNA，位于人類染色體11q13，通過促進(jìn)p53表達(dá)并激活其下游信號(hào)通路，起到抑制腫瘤的作用。miRNA-192可產(chǎn)生miRNA-192-3p和miRNA-192-5p兩條成熟的鏈,其中miRNA-192-5p是一種多功能的調(diào)節(jié)因子，可對(duì)p53產(chǎn)生正向反饋?zhàn)饔?，被認(rèn)為在多種疾病的生理病理中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-192-5p可通過抑制ZEB2mRNA的表達(dá)與肝癌的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示miRNA-192-5p在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中表達(dá)水平為0.72±0.11，在正常對(duì)照組血清中表達(dá)水平為1.08±0.15(P<0.05)，ROC曲線分析結(jié)果顯示，miRNA-192-5p診斷多發(fā)性骨髓瘤的曲線下面積為0.653，截?cái)嘀禐?.65，敏感性為77%，特異度為56%，P=0.023，這提示miRNA-192-5p可能在多發(fā)性骨髓瘤患者中作為抑癌基因起作用。

為進(jìn)一步探討miRNA-192-5p低表達(dá)是否能監(jiān)測多發(fā)性骨髓瘤的病情進(jìn)展，本研究對(duì)患者miRNA-192-5p表達(dá)量與多發(fā)性骨髓瘤臨床診斷、分期等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-192-5p的表達(dá)水平在β2-MG、肌酐含量高的多發(fā)性骨髓瘤患者血清中明顯低于β2-MG含量正常的患者(P<0.05)，miRNA-192-5p的表達(dá)水平在血紅蛋白及白蛋白低下的患者血清中明顯低于血紅蛋白及白蛋白正常的患者(P<0.05)；多發(fā)性骨髓瘤患者血清中miRNA-192-5p的表達(dá)水平分別與IgG和IgA含量呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.457，-0.615，P<0.05)。這提示miRNA-192-5p的表達(dá)水平與多發(fā)性骨髓瘤的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，其水平越低，患者預(yù)后就越差。

綜上所述，miRNA-192-5p在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中存在異常低表達(dá)，在多發(fā)性骨髓瘤的診斷中只可作為一個(gè)輔助診斷標(biāo)準(zhǔn)，其與疾病分期和預(yù)后相關(guān)指標(biāo)具有一定相關(guān)性，在多發(fā)性骨髓瘤疾病進(jìn)展監(jiān)測中是一個(gè)較好的標(biāo)志物。