白 璐, 劉承一, 張晶晶, 高東奇, 李文鑫, 李青山

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，河北 承德 067000)

放療是惡性腫瘤的主要治療手段之一，放療在治療腫瘤的過程中，通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫微環(huán)境，不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用，還能使機(jī)體的免疫細(xì)胞被激活，促使機(jī)體的免疫細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，啟動(dòng)人體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生旁觀者效應(yīng)或遠(yuǎn)位效應(yīng)[1]。通過不斷研究，人們逐漸開始重視放療可以輔助機(jī)體激活免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要作用[2]。本研究通過監(jiān)測(cè)樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC細(xì)胞)數(shù)量及其存活率，探討放療對(duì)非小細(xì)胞肺癌受試者放療過程中免疫功能的影響，從而為放療聯(lián)合免疫治療選擇最佳的治療時(shí)機(jī)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象:將我科2017年1月至2018年6月收治的非小細(xì)胞肺癌患者統(tǒng)一收集，收集患者必須經(jīng)影像學(xué)或組織病理學(xué)檢查，并且為不可切除的非小細(xì)胞肺癌患者，共30例。納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)活檢組織病理學(xué)或穿刺組織細(xì)胞學(xué)證實(shí)的非小細(xì)胞肺癌患者，年齡小于70歲；②放射治療總劑量6000cGy/200cGy/30f，預(yù)計(jì)生存時(shí)間大于3個(gè)月；③患者既往未接受過放射治療，且不能同時(shí)給予免疫治療及化學(xué)治療；④Karnofsky評(píng)分(卡氏評(píng)分，KPS評(píng)分)不低于70分；⑤心肝腎等臟器功能無異常；⑥血常規(guī)中白細(xì)胞、血小板及血紅蛋白均在正常范圍。排除標(biāo)準(zhǔn):①放射治療過程中需同時(shí)給予免疫治療或化學(xué)治療的患者；②既往給予過胸部放射治療的患者。

1.2方 法

1.2.1治療情況:放射治療前要對(duì)入組患者進(jìn)行基線評(píng)估包括：①明確的組織活檢病理學(xué)診斷或穿刺細(xì)胞學(xué)診斷；②血常規(guī)、尿常規(guī)、便常規(guī)、生化全項(xiàng)、凝血七項(xiàng)等實(shí)驗(yàn)室檢查；③淋巴結(jié)彩超、心電圖、頸胸腹部CT等影像學(xué)檢查。

1.2.2放射治療:入組患者完善基線檢查后，于CT下行放射治療前模擬定位，應(yīng)用熱塑體膜固定于胸腹平架上，做好標(biāo)記，然后進(jìn)行CT掃描，將CT掃描的定位圖像傳輸至放療計(jì)劃系統(tǒng)(Monaco系統(tǒng))，在放療計(jì)劃系統(tǒng)中逐層勾畫可見靶區(qū)及危及器官，確定放療劑量，采用適形調(diào)強(qiáng)放療(IMRT)技術(shù)進(jìn)行治療，然后由物理師制定出放療計(jì)劃，驗(yàn)證無誤后進(jìn)行治療。我科放射治療機(jī)器為醫(yī)科達(dá)直線加速器synergy，患者每周一至周五放療，第日1次，每次放療劑量200cGy?？偟膭┝繛?000cGy。

1.2.3受檢血樣的采集及檢測(cè)方法:上述入組患者均空腹抽取血樣，血樣采集時(shí)間為放射治療前1周、放射治療2000cGy、放射治療4000cGy、放射治療6000cGy，標(biāo)本量為靜脈血5ml。主要檢測(cè)指標(biāo)：DC細(xì)胞計(jì)數(shù)、DC細(xì)胞凋亡數(shù)、DC細(xì)胞存活率(存活DC細(xì)胞數(shù)/總DC細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.2.4檢測(cè)方法：免疫磁珠法檢測(cè)DC細(xì)胞(北京康泰合元生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的樹突狀細(xì)胞分離試劑盒、磁力架)

2 結(jié) 果

2.1入組患者放療前及放療后不同劑量時(shí)血清中DC細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化:DC細(xì)胞數(shù)在放療2000cGy、4000cGy、6000cGy后逐漸升高，F(xiàn)=8.53，P<0.001(表1和圖1、5～8)。

圖1 放療前及放療后不同時(shí)期DC細(xì)胞計(jì)數(shù)

2.2入組患者放療前及放療后不同劑量時(shí)血清中DC細(xì)胞存活數(shù)的變化:存活DC細(xì)胞數(shù)表現(xiàn)為先升高此后逐漸降低的趨勢(shì)，DC細(xì)胞存活數(shù)于放療4000cGy時(shí)升至最高，此后在放療6000cGy時(shí)已下降，并且放療4000cGy時(shí)的DC細(xì)胞存活數(shù)與放療前1周、放療6000cGy比較F=6.88，P<0.05(見表1和圖2、5～8)。

圖2 放療前和放療后不同時(shí)期活DC細(xì)胞數(shù)

2.3入組患者放療前及放療后不同劑量時(shí)血清中凋亡DC細(xì)胞數(shù)的變化:凋亡DC細(xì)胞數(shù)在放療過程中未見規(guī)律性的變化，凋亡DC細(xì)胞數(shù)在放療4000cGy時(shí)達(dá)到最高，放療6000cGy時(shí)的DC細(xì)胞數(shù)與放療前1周、放療2000cGy、放療4000cGy比較F=3.68，P=0.015(見表1和圖3、5～8)。

圖3 放療前及放療后不同時(shí)期凋亡DC細(xì)胞數(shù)

2.4入組患者放療前及放療后不同劑量時(shí)血清中DC細(xì)胞存活率的變化:DC細(xì)胞存活率在放射治療前與放療不同劑量時(shí)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=0.839，P=0.476(表1和圖4、5～8)。

圖4 放療前及放療后不同時(shí)期DC細(xì)胞活性

表1 不同放療階段DC細(xì)胞總數(shù) 活DC細(xì)胞數(shù) 凋亡DC細(xì)胞數(shù) DC細(xì)胞活性的變化

2.5肺癌患者放療前及放療后不同劑量時(shí)血清中DC細(xì)胞檢測(cè)分析圖應(yīng)用:免疫磁珠法于放射治療前1周、放療2000cGy、4000cGy、6000cGy檢測(cè)DC細(xì)胞數(shù)的分析圖。(見圖5、6、7、8)

圖5 放療前1周

圖6 2000cGy

圖7 4000cGy

圖8 6000cGy

3 討 論

DC細(xì)胞是目前所研究出的體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，根據(jù)其來源，可分為淋巴系統(tǒng)來源的DC細(xì)胞及髓系來源的DC細(xì)胞，淋巴系來源的DC細(xì)胞與NK細(xì)胞及T細(xì)胞有共同的祖細(xì)胞；髓系來源的DC細(xì)胞與單核細(xì)胞及粒細(xì)胞有共同的祖細(xì)胞。DC細(xì)胞從它的前體階段、未成熟階段、遷移階段和成熟階段逐漸發(fā)育成熟。DC細(xì)胞受到外界因素強(qiáng)烈刺激后即由未成熟階段向成熟階段轉(zhuǎn)化[3]。未成熟階段的DC細(xì)胞雖具有很強(qiáng)的加工及抗原捕獲能力，但是其抗原提呈能力很弱；而成熟階段的DC細(xì)胞雖加工及捕獲抗原的能力降低，但有很強(qiáng)的抗原提呈能力。另外，DC細(xì)胞表面高表達(dá)MHC 1I類分子I-A/I-E和分泌IL-12[4,5]。MHC-II類分子位于抗原提呈細(xì)胞上，是啟動(dòng)免疫的主要介質(zhì)。IL-12是主要的免疫因子。因此，說明DC細(xì)胞與免疫功能密切相關(guān)。一直以來，放射治療影響機(jī)體的免疫功能主要通過對(duì)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等方面來實(shí)現(xiàn)，最近通過對(duì)免疫治療的深入研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DC作為連接固有免疫和獲得性免疫的紐帶，是體內(nèi)最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，在機(jī)體的免疫反應(yīng)中起著主要的調(diào)節(jié)作用[6]，而放射治療對(duì)DC細(xì)胞的影響無論是國(guó)內(nèi)還是國(guó)外都研究甚少。近年來，國(guó)內(nèi)外研究顯示放療通過促進(jìn)DC細(xì)胞成熟、遷移，進(jìn)而激活機(jī)體的免疫應(yīng)答[7]。目前對(duì)于放療促進(jìn)DC細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境遷移從而發(fā)揮抗腫瘤作用的研究，主要基于細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[8]，多給予荷瘤小鼠大分割體外照射，從而獲得放射治療對(duì)DC細(xì)胞抗腫瘤作用的促進(jìn)作用，但在人體的研究未見報(bào)道。故本試驗(yàn)的研究對(duì)象為肺癌患者，給予常規(guī)劑量照射，收集放療前及放療后4個(gè)劑量點(diǎn)(放療前1周、放療2000cGy、放療4000cGy、放療6000cGy)的DC細(xì)胞數(shù)、存活DC細(xì)胞數(shù)、凋亡DC細(xì)胞數(shù)分別進(jìn)行放療前與放療后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明常規(guī)劑量放療可影響DC細(xì)胞存活及凋亡；通過本研究顯示DC細(xì)胞計(jì)數(shù)隨著放療劑量的增加呈逐漸增高趨勢(shì)，而活DC細(xì)胞數(shù)于放療4000cGy時(shí)最高，呈現(xiàn)隨著一定劑量的增加而升高此后再降低的現(xiàn)象，故得出在放療達(dá)4000cGy時(shí)放療促進(jìn)DC細(xì)胞的作用最強(qiáng)，與以往的[9]研究結(jié)果相吻合。而在放射治療6000cGy時(shí)DC細(xì)胞數(shù)呈降低趨勢(shì)，DC細(xì)胞凋亡數(shù)的變化未見明顯規(guī)律性，放療4000cGy時(shí)凋亡數(shù)最多，不除外放療4000cGy時(shí)放療使機(jī)體的腫瘤細(xì)胞大量壞死，壞死細(xì)胞釋放多種腫瘤相關(guān)抗原，而DC細(xì)胞可發(fā)揮抗原提呈作用，從而即被消耗所致。研究顯示放射治療通過與PD-1/PD-L1聯(lián)合能協(xié)同激活機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答[10]。腫瘤患者常規(guī)放療時(shí)活DC數(shù)在放療6000cGy時(shí)下降，故若在放療6000cGy時(shí)給予患者免疫刺激治療，使DC細(xì)胞數(shù)維持在較高水平，免疫促進(jìn)作用，進(jìn)而激活機(jī)體特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答，即可以達(dá)到DC細(xì)胞長(zhǎng)效抗腫瘤作用，對(duì)肺癌患者的治療起到積極的作用。通過本試驗(yàn)為肺癌患者放療過程中聯(lián)合免疫治療選擇最佳時(shí)機(jī)提供了一定的理論依據(jù)。研究結(jié)果顯示DC細(xì)胞存活率放療前與放療后不同劑量點(diǎn)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明放療對(duì)DC細(xì)胞的存活率未見明顯影響。

隨著對(duì)抗腫瘤免疫的不斷研究，放化療與免疫治療相結(jié)合將會(huì)給腫瘤患者帶來希望，在最佳的治療時(shí)機(jī)給予最佳的放射劑量將給患者帶來最大的受益。