韓永潔，劉世杰，鄧 露

(青海省人民醫(yī)院頜面外科，青海 西寧 810007)

口腔黏膜是抵抗機(jī)械刺激、毒性物質(zhì)及微生物入侵的重要結(jié)構(gòu)，對(duì)于口腔功能的維持具有重要意義，而外傷、口腔黏膜良性及惡性改變均可造成黏膜缺損，造成一定功能障礙[1]。目前口腔黏膜缺損及重建主要依靠自體皮片移植、帶蒂的肌皮瓣等方式完成，但均具有明顯的局限性，一方面自體取皮可加重患者的創(chuàng)面損傷，增加其痛苦，另一方面自體移植的成活率較低，效果不佳[2]。組織工程技術(shù)是將功能相關(guān)的種子細(xì)胞通過(guò)體外培養(yǎng)后種植于天然可降解生物材料上，將二者培養(yǎng)的產(chǎn)物植入人體缺損部位，在人體條件下，種子細(xì)胞增殖、分化形成特定形態(tài)、功能的器官或組織，而支架材料則逐漸被降解[3]。成纖維細(xì)胞是口腔黏膜固有層的基本組成細(xì)胞，其具有合成、更新基質(zhì)的能力，這一特性也為口腔黏膜的組織工程培養(yǎng)提供了前提[4]。目前臨床常用的組織工程支架材料主要包括脫細(xì)胞真皮基質(zhì)、納米纖維絲素蛋白、聚羥基乙酸、聚乳酸羥基乙酸等，這些材料均有一定優(yōu)缺點(diǎn)及局限性。納米纖維絲素蛋白是一種天然的大分子材料，作為組織工程支架材料可較好的支持種子細(xì)胞的黏附、增殖及分化，目前已有關(guān)于其培養(yǎng)出神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、角皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、纖維原細(xì)胞的研究，且這些研究均顯示該材料培養(yǎng)下的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，結(jié)構(gòu)完整[5]。本研究擬探討納米纖維絲素蛋白修復(fù)口腔黏膜的效果，并與目前臨床常見(jiàn)的同種(人皮)及異種(牛皮)脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)材料修復(fù)效果進(jìn)行比較，觀察口腔黏膜生長(zhǎng)速度、炎癥反應(yīng)及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，旨在為納米纖維絲素蛋白修復(fù)口腔黏膜缺損提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：80只3月齡雄性Wister清潔級(jí)大鼠，體重220～250g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，保持環(huán)境溫度適宜。本研究經(jīng)本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合動(dòng)物保護(hù)及使用相關(guān)規(guī)定。主要實(shí)驗(yàn)儀器：石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leika公司)；倒置相差電子顯微鏡，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。主要實(shí)驗(yàn)試劑：同種異型脫細(xì)胞基質(zhì)購(gòu)自北京清源生物科技有限公司，異種脫細(xì)胞基質(zhì)購(gòu)自正海生物技術(shù)有限公司，納米纖維絲素蛋白購(gòu)自武漢博士德公司；抗CD34兔抗大鼠抗體、廣譜細(xì)胞角蛋白抗體、羊抗鼠通用抗體、SABC通用免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法：動(dòng)物分組及處理：①動(dòng)物分組：將大鼠隨機(jī)分為A(納米纖維絲素組，n=20)、B(牛皮脫細(xì)胞基質(zhì)組，n=20)、C(人皮脫細(xì)胞基質(zhì)組，n=20)、D組(空白對(duì)照組，n=20)。②動(dòng)物建模及處理：采用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒鋪巾，麻醉成功后各組大鼠均于顯微鏡下手術(shù)切除直徑10mm的全層口腔頰黏膜，充分止血。A、B、C組大鼠分別取同一直徑(10mm)、經(jīng)輻照滅菌的絲素蛋白、異種(牛皮)脫細(xì)胞基質(zhì)、同種(人皮)脫細(xì)胞基質(zhì)反鋪于單層凡士林紗布上，用7-0縫線將紗布縫合于口腔黏膜，取凡士林油紗布覆蓋，0號(hào)絲線縫合固定；D組大鼠用凡士林紗布覆蓋，用0號(hào)絲線縫合。術(shù)后大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)，不進(jìn)行抗感染治療，自由飲食，術(shù)后7d拆線，保持鼠籠清潔。

1.3標(biāo)本取材及指標(biāo)檢測(cè)：黏膜狀態(tài)觀察：觀察各組大鼠全身狀態(tài)，術(shù)后1周每組大鼠隨機(jī)挑選5只大鼠，常規(guī)腹腔麻醉后觀察口腔黏膜色澤、滲出液情況、愈合情況，采用游標(biāo)卡尺測(cè)定口腔黏膜缺損直徑，測(cè)定時(shí)取三個(gè)不同位點(diǎn)測(cè)定，取平均值，測(cè)量完畢后標(biāo)記大鼠，于術(shù)后2周、3周、4周時(shí)進(jìn)行測(cè)量。HE染色：于術(shù)后1、2、3、4周時(shí)每組挑選5只大鼠，常規(guī)處死，取5×5mm口腔黏膜創(chuàng)面組織，取材后迅速采用10%福爾馬林固定。固定標(biāo)本切取3mm×3mm大小，常規(guī)石蠟包埋，采用切片機(jī)切取4μm切片，經(jīng)烤片、脫蠟、梯度酒精逐級(jí)復(fù)水、蘇木素染色、沖洗、分化、伊紅復(fù)染、脫水、透明等操作后，以中性樹(shù)膠封片，采用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織的觀察，先于低倍鏡下找到合適的視野再進(jìn)行高倍鏡觀察。免疫組化：取4μm石蠟切片，烤片后采用二甲苯脫蠟，磷酸緩沖液(PBS)沖洗，滴加0.3%過(guò)氧化氫甲醇溶液50μL滅活過(guò)氧化物酶處理10min，微波修復(fù)抗原10min，PBS沖洗3次，滴加50μL山羊血清，孵育10min，加入標(biāo)記的一抗(CD34兔抗鼠單克隆抗體，小鼠抗大鼠CK單抗，陰性對(duì)照滴加PBS溶液)室溫孵育1h，PBS沖洗3次，滴加標(biāo)記的二抗(生物素標(biāo)記的羊抗鼠通用抗體)，室溫孵育10min，PBS沖洗3次，滴加50μL辣根標(biāo)記鏈霉卵白素(SP)工作液，孵育10min，PBS沖洗3次，加入DAB顯色液，采用蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染后用0.1%鹽酸溶液分化，PBS沖洗，經(jīng)梯度酒精脫水、透明后封片，顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)黏膜狀態(tài)情況：術(shù)后1周時(shí)觀察各組大鼠頰側(cè)黏膜縫線均無(wú)脫落；A、B、C組大鼠術(shù)后1周拆線后可見(jiàn)移植區(qū)有少量新生上皮，創(chuàng)面見(jiàn)透明膜狀物，周圍無(wú)明顯紅腫；術(shù)后3周時(shí)A組可見(jiàn)創(chuàng)面新生黏膜與周圍組織無(wú)明顯界限，部分大鼠創(chuàng)面未完全愈合，B、C兩組創(chuàng)口直徑收縮較大，少量創(chuàng)面未愈合。經(jīng)比較，術(shù)后1、2、3周時(shí)D組大鼠創(chuàng)面直徑顯著大于A、B、C組，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、表1。

圖1 術(shù)后各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面直徑大小情況

表1 術(shù)后各組時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面直徑大小變化

2.2HE染色觀察各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)成纖維細(xì)胞密度、炎性細(xì)胞數(shù)情況：HE染色顯示，A、B、C組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)成纖維細(xì)胞數(shù)、炎性細(xì)胞數(shù)均顯著低于D組，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A、B、C組大鼠各時(shí)間點(diǎn)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖2、圖3、表2、表3。

圖2 術(shù)后各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)黏膜HE染色情況

圖3 術(shù)后各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)黏膜CK染色情況

表2 四組新生組織中成纖維細(xì)胞密度比較(cell/高倍視野

表3 四組新生組織中炎性細(xì)胞密度比較(cell/高倍視野

2.3各組大鼠黏膜CK染色情況分析：免疫組化CK染色顯示，術(shù)后各組黏膜均有上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，A、B、C組術(shù)后1、2、3、4周時(shí)大鼠CK陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)顯著高于D組，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A、B、C組大鼠各時(shí)間點(diǎn)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 四組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)CK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(cell/高倍視野

2.4各組大鼠術(shù)后黏膜組織中CD34染色情況分析：免疫組化CD34染色顯示，A、B、C組術(shù)后1、2、3周時(shí)CD34陽(yáng)性表達(dá)數(shù)顯著高于D組(P<0.05)，術(shù)后4周各組CD34表達(dá)情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A、B、C組大鼠各時(shí)間點(diǎn)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖4、表5。

圖4 術(shù)后各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)黏膜CD34染色情況

表5 四組新生組織中CD34陽(yáng)性細(xì)胞比較(cell/高倍視野

3 討 論

目前認(rèn)為理想的組織工程修復(fù)材料需具備以下幾個(gè)要點(diǎn)：良好的生物相容性、良好的可降解性、可控的降解速度、優(yōu)良的三維孔隙結(jié)構(gòu)及來(lái)源便捷，其中良好的生物相容性是必備條件。本研究中采用納米纖維絲素蛋白、人皮脫細(xì)胞基質(zhì)、牛皮脫細(xì)胞基質(zhì)的組別在術(shù)后1周即出現(xiàn)創(chuàng)面的愈合，且術(shù)后1、2、3周時(shí)創(chuàng)面愈合程度顯著優(yōu)于空白對(duì)照組，提示三種材料均由較好的組織修復(fù)效果。三種材料對(duì)于創(chuàng)面愈合的影響比較結(jié)果顯示，三種材料各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面大小無(wú)明顯差異，提示三種材料促進(jìn)創(chuàng)面愈合的速率相當(dāng)。既往王忠朝[6]等開(kāi)展的一項(xiàng)動(dòng)物研究顯示，采用納米纖維絲素蛋白、自體、異體細(xì)胞基質(zhì)的大鼠術(shù)后3、5、7d時(shí)口腔黏膜缺損均顯著低于空白對(duì)照組，另外納米纖維絲素蛋白組大鼠黏膜缺損直徑也顯著低于自體、異體細(xì)胞基質(zhì)；而國(guó)外一項(xiàng)研究證實(shí)，納米纖維絲素蛋白、人皮脫細(xì)胞基質(zhì)對(duì)口腔黏膜的修復(fù)及再生有相當(dāng)?shù)淖饔眯Ч鸞7]，本研究與后者研究結(jié)果類似，與前者研究結(jié)果存在一定差異的原因可能為本研究與其觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)不同所致，另外也有研究表明，不同材料修復(fù)黏膜的速率可能存在較大差異，而本研究中未對(duì)術(shù)后7d內(nèi)黏膜修復(fù)情況進(jìn)行分析。

口腔黏膜與皮膚一般結(jié)構(gòu)類似，成纖維細(xì)胞是口腔黏膜固有層的基本組成細(xì)胞，現(xiàn)有研究表明，口腔黏膜的成纖維細(xì)胞在上皮形成及上皮、真皮之間的黏附作用發(fā)揮重要作用，同時(shí)也可影響上皮細(xì)胞的增殖分化及內(nèi)皮細(xì)胞的遷移過(guò)程。本研究對(duì)各組大鼠術(shù)后黏膜成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組比較，采用納米纖維絲素蛋白、自體、異體細(xì)胞基質(zhì)的大鼠術(shù)后1、2、3、4周時(shí)成纖維細(xì)胞密度較高；納米纖維絲素蛋白、自體、異體細(xì)胞基質(zhì)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示納米纖維絲素蛋白在促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖方面有較好的效果，可能為促進(jìn)創(chuàng)面預(yù)后的機(jī)制之一。既往開(kāi)展的一項(xiàng)動(dòng)物研究表明，絲素纖維蛋白支架用于構(gòu)建口腔黏膜固有層效果較好，大鼠口腔成纖維細(xì)胞可在支架表面黏附、增殖、生長(zhǎng)并逐漸形成黏膜，促進(jìn)上皮生長(zhǎng)。本研究與其研究結(jié)果類似?？谇火つp傷可造成機(jī)體炎癥反應(yīng)的增加，有研究表明，與皮膚愈合過(guò)程不同的是，口腔黏膜愈合過(guò)程中的炎癥呈一過(guò)性進(jìn)展。本研究對(duì)黏膜損傷大鼠黏膜炎癥細(xì)胞進(jìn)行分析結(jié)果顯示，各處理組大鼠炎癥細(xì)胞顯著低于空白對(duì)照組大鼠，與成纖維細(xì)胞數(shù)量變化趨勢(shì)類似，各處理組炎癥細(xì)胞數(shù)比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析納米纖維絲素蛋白、自體、異體細(xì)胞基質(zhì)對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)的機(jī)制，一方面，與空白對(duì)照組比較，各處理組別大鼠創(chuàng)面愈合過(guò)程較快，降低創(chuàng)面持續(xù)刺激引起的炎癥反應(yīng)升高；另一方面，既往研究認(rèn)為，成纖維細(xì)胞除合成膠原、構(gòu)成組織連接成分外，其也可輔助炎癥反應(yīng)過(guò)程，促進(jìn)炎癥的消退，這一特性可能是各材料對(duì)炎癥細(xì)胞有一定影響的原因。

另外，本研究采用免疫組化進(jìn)行CD34、CK染色分析各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞及黏膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示，各組大鼠黏膜CD34陽(yáng)性表達(dá)顯著高于D組，提示在納米纖維絲素蛋白、自體、異體細(xì)胞基質(zhì)等支架的作用下，黏膜血管內(nèi)皮得到更好的生長(zhǎng)，考慮可能為生物支架材料可為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)入提供基礎(chǔ)。CK染色顯示各組大鼠創(chuàng)緣早期均有上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，而D組僅有少量上皮細(xì)胞，術(shù)后1、2、3周時(shí)創(chuàng)面的新生上皮細(xì)胞顯著多于D組，進(jìn)一步提示采用納米纖維絲素蛋白、自體、異體細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)口腔黏膜缺損有助于上皮生長(zhǎng)，對(duì)重建黏膜缺損有較好的價(jià)值。

綜上，納米纖維絲素蛋白、自體、異體細(xì)胞基質(zhì)對(duì)大鼠口腔黏膜損傷具有相當(dāng)?shù)男迯?fù)效果，但脫細(xì)胞基質(zhì)在來(lái)源方面比較少，且存在倫理學(xué)的限制；現(xiàn)有的脫細(xì)胞基質(zhì)在使用過(guò)程中多價(jià)格較為昂貴，患者難以承受；另外其也有引起傳染性疾病傳播的弊端，納米纖維絲素蛋白具有相對(duì)較廣的來(lái)源，為口腔黏膜缺損修復(fù)提供新的思路。