胡俊輝，王 瑩，趙靜怡，李建會(huì)，肖 旭，姜艷平，姚銀輝，宋 紅

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河北 承德 067000 2.承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

隨著抗菌藥物長(zhǎng)期廣泛、過度、不合理的應(yīng)用，導(dǎo)致耐藥菌頻繁出現(xiàn)，并呈逐年上升趨勢(shì)，致使感染患者病情加重、死亡率提高，給臨床治療帶來極大困難[1]。近年來，越來越多的研究顯示，中藥及其復(fù)方制劑具有一定的抗菌作用，甚至體外研究顯示中藥及其復(fù)方制劑有逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥的作用[2,3]。CHINET細(xì)菌監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)菌株分離率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)美羅培南和亞胺培南的耐藥率上升幅度高達(dá)8倍，；鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii，AB)對(duì)美羅培南和亞胺培南的耐藥率分別為69.3%和66.7%[1]。復(fù)方紅根草片是由金銀花、穿心蓮、紅根草、魚腥草、野菊花5 味中藥組成的復(fù)方制劑，臨床常用于治療急性咽喉炎、扁桃體炎、腸炎等。本研究分析復(fù)方紅根草片及其組方5種中藥對(duì)耐藥肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的抗菌活性及逆轉(zhuǎn)耐藥性，為抗菌治療提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株:碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP)源于2017年承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院痰液分離菌株118株中的10株，耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(Multi-drug resistant Acinetobacter baumanii, MDR-AB)源于2016年11月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院患者痰液分離菌株的中的10株，剔除同一患者同一來源的重復(fù)菌株。所有菌株均源于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，VITEK 2-Compact GN卡鑒定。

1.1.2儀器與試劑:VITEK 2-Compact GN-AST09藥敏卡(法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品)；水解酪蛋白瓊脂(MH)購(gòu)自溫州康泰公司；藥敏紙片OXOID產(chǎn)品：哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢他啶、亞胺培南和美羅培南。

1.1.3實(shí)驗(yàn)用藥:復(fù)方紅根草片(桂林三金藥業(yè))，規(guī)格0.31g/片，每片相當(dāng)于干膏0.12g；金銀花、穿心蓮、紅根草、魚腥草、野菊花購(gòu)自中國(guó)藥材。

1.2方 法

1.2.1藥液制備:將復(fù)方紅根草片溶于蒸餾水后進(jìn)行濃縮，使用濃度達(dá)到1g/mL，過濾除菌密封后置4℃保存。將5種草藥分別取50g，分別加入5倍量蒸餾水100℃加熱3h，冷卻，過濾，濾渣再加250mL蒸餾水100℃加熱2h，分別合并藥液濃縮至50mL，相對(duì)濃度為1g/mL，過濾，取上清液，高壓滅菌，于4℃保存。

1.2.2菌液制備:將菌株接種于MH培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24h，稀釋至濃度10×106CFU/mL，4℃冷藏備用。

1.2.3抑菌活性的測(cè)定:根據(jù)2017美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦，采用微量肉湯稀釋法分別測(cè)定復(fù)方紅根草片及其組方中5味草藥的抗菌藥的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。每組取10支試管編號(hào)，分別加入1mL肉湯，1號(hào)試管中加入1mL藥液，混勻后取1mL加入2號(hào)試管，混勻后取2號(hào)試管液體1mL加入3號(hào)試管，以此類推，至9號(hào)試管取1mL液體棄去，10號(hào)試管為對(duì)照組，不加藥液。于37℃培養(yǎng)24h，根據(jù)濁度變化，判讀MIC值。每組重復(fù)3次，取平均值。

1.3逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性試驗(yàn):分別測(cè)定抗菌藥物單藥的MIC，方法同復(fù)方紅根草片，抗菌藥物為亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、慶大霉素、頭孢吡肟。后測(cè)定兩藥聯(lián)合用藥的MIC值，組合方式為復(fù)方紅根草片及其組方5味中藥分別與上述四種抗菌藥物聯(lián)用。方法同單藥MIC測(cè)定。聯(lián)合用藥的抗菌活性用聯(lián)合用藥指數(shù)∑FIC表示，該數(shù)值計(jì)算方法如下：∑FIC=FIC-A+FIC-B，其中FIC-A表示B藥存在時(shí)A藥的MIC值與A藥單藥的MIC值之比，F(xiàn)IC-B表示A藥存在時(shí)B藥的MIC值與B藥單藥的MIC值之比。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為：∑FIC≤0.5表示兩藥有協(xié)同作用，∑FIC>4時(shí)表示兩藥有拮抗作用，0.5<∑FIC≤4表示兩藥無(wú)相關(guān)作用。

2 結(jié) 果

2.1抑菌作用結(jié)果:對(duì)CRKP抑菌試驗(yàn)中，復(fù)方紅根草片的MIC為256μg/mL，組方中野菊花無(wú)抑菌作用，金銀花、穿心蓮、紅根草、魚腥草的MIC分別為500μg/mL、125μg/mL、125μg/mL、62.56μg/mL。對(duì)MDR-AB試驗(yàn)中，復(fù)方紅根草片、穿心蓮、紅根草均無(wú)抑菌作用，魚腥草、野菊花、金銀花的MIC分別為62.5μg/mL、1000μg/mL，1000μg/mL，見表1。

表1 復(fù)方紅根草片及其組方對(duì)CRKP和MDR-AB的MIC值

2.2逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性試驗(yàn)結(jié)果:上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，復(fù)方紅根草片對(duì)MDR-AB沒有抑菌作用，因此逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性試驗(yàn)只研究了CRKP菌。單藥對(duì)CRKP的結(jié)果如表2所示，CRKP對(duì)亞胺培南耐藥。聯(lián)合用藥抗菌活性試驗(yàn)如表3所示，紅根草與亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、慶大霉素有協(xié)同作用，金銀花與頭孢哌酮有協(xié)同作用，穿心蓮與亞胺培南、慶大霉素有協(xié)同作用，紅根草與亞胺培南、頭孢哌酮、慶大霉素有協(xié)同作用，魚腥草與亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、頭孢吡肟有協(xié)同作用，野菊花對(duì)CRKP無(wú)明顯作用，其他聯(lián)合用藥組均無(wú)相互作用。

表2 抗菌藥物單藥和兩藥聯(lián)合對(duì)CRKP的MIC值

表3 聯(lián)合用藥的∑FIC值

3 討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染的重要致病菌，其檢出率與耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，針對(duì)兩種耐藥菌的臨床治療藥物的選擇性很小，如何選擇耐藥菌的有效治療已成為世界難題[4]。大量研究顯示中藥材及其復(fù)方制劑在具有良好的抗菌作用，甚至對(duì)多重耐藥菌已有較好的抗菌活性，甚至可以逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性[5,6]。中藥通過直接抑制細(xì)菌和提高人體免疫力間接抗菌，目前研究較多集中在中藥材及其復(fù)方制劑的抗菌作用研究，包括活性成分、作用靶點(diǎn)等，本課題組在一項(xiàng)研究中使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了紅根草化學(xué)成分的分子機(jī)制，其關(guān)鍵作用蛋白基因PLG、MASP1、MASP2等涉及的主要信號(hào)通路和金色葡萄球菌感染有關(guān)。

隨著本院碳青霉烯類抗菌藥物的使用，導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥比例逐年上升，給臨床治療帶來困難。本試驗(yàn)研究了復(fù)方紅根草片及其組方5味中藥材對(duì)我院提取的MDR-AB和CRKP的抗菌作用及耐藥性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，復(fù)方紅根草片及5味中藥材對(duì)MDR-AB抗菌作用不明顯；對(duì)CRKP抗菌作用，除野菊花外均有一定的抗菌活性；在對(duì)CRKP耐藥性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)顯示，復(fù)方紅根草片及5味中藥與選用4種抗菌藥物有一定的協(xié)同作用。中藥及其復(fù)方制劑逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性效果明確，但中藥逆轉(zhuǎn)耐藥性的機(jī)制比較復(fù)雜，主要有消除R質(zhì)粒、抑制β內(nèi)酰胺酶、影響外排轉(zhuǎn)運(yùn)因子的表達(dá)、對(duì)抗菌藥物具有增敏效果[7]等。章如玲[8]等研究了肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因分布與耐藥性的關(guān)系，以KPC-2為主，主要克隆系為ST11、ST15、ST764。

本研究結(jié)果顯示復(fù)方紅根草片及其組方5味中藥材對(duì)CRKP具有耐藥性逆轉(zhuǎn)效果，給臨床用藥研究提供一些依據(jù)。目前，對(duì)于中藥材及其復(fù)方制劑的抗菌活性及耐藥性研究主要為體外試驗(yàn)，而且主要針對(duì)單獨(dú)菌株，因此，具有一定局限性，如中藥材產(chǎn)地不同、亞種不同、試驗(yàn)菌多來源多元化等。在實(shí)際臨床應(yīng)用中，中藥材及其制劑作用于機(jī)體或靶器官的過程較為復(fù)雜，因此，抗菌及逆轉(zhuǎn)耐藥作用與各個(gè)化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)關(guān)系還需要深入研究，為中藥材及其制劑的開發(fā)利用提供依據(jù)。