何樹華,劉曉紅,周清清,江 虹
(長江師范學院化學化工學院,長江師范學院武陵山片區(qū)綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶 408100)
美司那又名α-巰基乙基磺酸鈉鹽,為抗腫瘤類輔助藥,對泌尿系統(tǒng)有特殊的保護作用。由于美司那結(jié)構(gòu)中巰基(-SH)的存在,可以預防人體進行腫瘤化療時,所用高劑量環(huán)磷酰胺所引起的出血性膀胱炎等泌尿系統(tǒng)的上皮毒性,可以去除環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺所產(chǎn)生的毒性物質(zhì)丙烯酸,且不干擾母體藥物對腫瘤的化療效果。但作為一種新型的抗毒劑,如用藥過量時,可能使患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、過敏反應,或誘發(fā)低血壓、心率加快,或肝轉(zhuǎn)氨酶升高等副作用。為了合理用藥,對美司那藥物中的含量進行研究有著重要意義。
目前,國內(nèi)外對美司那的檢測方法研究很少,報道較多的方法是高效液相色譜法[1 - 7],也偶見離子色譜法[8]、分光光度法[9 - 11]及電化學法[12]等的報道。高效液相色譜法除儀器偏貴不易普及外,還存在前處理煩瑣、費時等不足。其它方法或靈敏度不夠高或選擇性欠佳或條件要求嚴格等。本工作采用高靈敏的瑞利光散射(RLS)技術(shù),利用堿性艷藍B與美司那之間的靜電作用,建立了檢測美司那的簡便、快速、高靈敏的RLS新方法,尚未見文獻報道。方法用于人體血液及藥物中美司那的測定,結(jié)果滿意。
F-2500型熒光分光光度計(日本,日立公司);pHS-3C型精密酸度計(上海虹益儀器儀表有限公司)。
美司那(Mesna,MSN;中國食品藥品檢定研究院)對照品溶液:164.2 mg/L(貯備液),存于4 ℃冰箱;臨用時取貯備液配成1.642 mg/L工作液。堿性艷藍B(Basic Brilliant Blue B,BASB;上海源葉生物科技有限公司)溶液:1.0×10-4mol/L。B-R緩沖溶液:取適量0.04 mol/L H3PO4、H3BO3和HAc與適量0.2 mol/L NaOH溶液混合,用酸度計測定,配成pH=3.5~10.2的溶液。所有試劑均為分析純,水為二次蒸餾水。
樣品:不同廠家生產(chǎn)的美司那注射液(1#和2#,市售只見這種劑型的藥物);人體血清(3#,長江師范學院校醫(yī)院提供)。
抽取1#和2#美司那注射液樣品各1支,內(nèi)容物分別置于1 000 mL容量瓶中,用水定容。準確移取該液5.00 mL置于另一1 000 mL容量瓶中,用水定容,即制得1#和2#待測液。取3#血清樣品2.00 mL,加適量三氯乙酸,振搖,以4 000 r/min離心分離15 min,取上清液2.00 mL置于50 mL容量瓶中,用水定容,即為3#待測液。
室溫下,準確移取0~1.00 mL MSN標準工作液(或MSN試液)于10 mL比色管中,依次加入1.50 mL pH=9.25 B-R緩沖溶液和3.00 mL堿性艷藍B溶液,搖勻后,用水定容。靜置20 min,在熒光分光光度計上同步掃描瑞利光散射(RLS)光譜,測定最大RLS波長355 nm處體系和試劑空白的RLS強度IRLS及I0,再計算出ΔIRLS=IRLS-I0。
圖1為MSN、BASB及他們以靜電作用相結(jié)合的RLS光譜圖。可知,MSN自身幾乎無散射,BASB自身有較弱的RLS信號,若在BASB溶液中加入pH=9.25 B-R緩沖溶液,則RLS信號顯著增強(λmax=355 nm,IRLS=1 672),在最大RLS峰的長波方向466 nm附近及555 nm處有相對較弱的散射峰。從圖可知,當在BASB的堿性溶液中加入不同用量的MSN標準工作液后,由于BASB是一種陽離子染料,可與MSN結(jié)構(gòu)中的-SO3H以靜電引力作用結(jié)合成離子締合物,使體系的摩爾質(zhì)量增大,導致RLS增強,其增強強度ΔIRLS隨著MSN用量的增大逐淅增強,當MSN處于一定濃度范圍內(nèi)時,其質(zhì)量濃度與ΔIRLS呈線性關(guān)系,可用于MSN的定量分析。實驗選用靈敏度最高的355 nm波長作為測定波長。
圖1 MSN與BASB的RLS光譜Fig.1 RLS spectra of MSN and BASB1:0.164 mg/L MSN;2:3.00×10-5 mol/L BASB;3 - 8:0.0,0.0328,0.0657,0.0985,0.131,0.164 mg/L MSN-3.00×10-5 mol/L BASB;pH=9.25.
2.2.1 介質(zhì)、酸度及用量室溫下,取1.00 mL MSN標準工作液、2.00 mL BASB溶液,考察1.00 mL相同pH值的各緩沖溶液(HAc-NaAc、B-R、Tris-HCl)對MSN與BASB以靜電引力結(jié)合生成的締合物時ΔIRLS的影響。實驗表明,使用B-R緩沖溶液時,RLS強度相對較大(ΔIRLS=788),體系靈敏度較高,故選用B-R緩沖溶液作反應介質(zhì)。相繼考察了不同pH值的B-R緩沖溶液對MSN與BASB以靜電引力結(jié)合生成的締合物的ΔIRLS的影響,見圖2。結(jié)果表明,在酸性范圍內(nèi),締合物受酸度影響小,在堿性范圍內(nèi),pH值的大小對締合物影響較大,最適酸度是pH=9.25。該條件下,體系的ΔIRLS相對最大,當大于或小于pH=9.25時,體系靈敏度均有不同程度降低??疾靝H=9.25 B-R緩沖溶液的用量對締合物ΔIRLS的影響時,實驗表明,用量在1.50~2.50 mL范圍內(nèi),ΔIRLS較大且基本不變。故實驗選用pH=9.25 B-R緩沖溶液1.50 mL來控制反應的酸度。
圖2 pH對ΔIRLS的影響Fig.2 Effect of buffer pH on ΔIRLSMSN:0.164 mg/L;BASB:2.0×10-5 mol/L.
2.2.2 BASB用量或濃度室溫下,取1.00 mL MSN標準工作液、1.50 mL pH=9.25 B-R緩沖溶液,考察0.50~4.00 mL BASB溶液對MSN與BASB以靜電引力結(jié)合生成的締合物的ΔIRLS的影響,見圖3。曲線表明,當BASB的用量在2.80~3.20 mL范圍內(nèi)(或體系溶液中BASB的濃度在2.8×10-5~3.2×10-5mol/L范圍內(nèi))時,ΔIRLS相對較大,實驗選用靈敏度最佳的BASB用量3.00 mL或體系溶液中最佳BASB濃度3.0×10-5mol/L。
圖3 BASB濃度對ΔIRLS的影響Fig.3 Effect of BASB concentration on ΔIRLSMSN:0.164 mg/L;B-R:pH=9.25,1.50 mL.
2.2.3 試劑加入順序室溫下,取1.00 mL MSN標準工作液及上述選定條件下的B-R緩沖溶液和BASB溶液,考察他們的加入順序?qū)SN與BASB以靜電引力結(jié)合生成的締合物的ΔIRLS的影響。實驗表明,ΔIRLS相對最大的試劑加入順序為:MSN溶液、B-R緩沖溶液、BASB溶液。故實驗選擇用最佳的試劑加入順序進行各項實驗。
2.2.4 時間及穩(wěn)定性室溫下,取1.00 mL MSN標準工作液,在上述選定實驗條件下,考察MSN與BASB的反應時間對其以靜電引力結(jié)合生成的締合物的ΔIRLS的影響。實驗表明,MSN與BASB的靜電相吸作用在20 min內(nèi),隨著反應的進行,ΔIRLS逐淅增大,20~80 min內(nèi),ΔIRLS達最大且基本不變。由此說明,MSN與BASB的反應在20 min內(nèi)可進行完全,穩(wěn)定時間至少1 h。故實驗選在20 min后進行測定。
分別取MSN標準工作液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于10 mL具塞比色管中,按選定的實驗條件加入其它試劑溶液,再按1.3的方法測定標準系列溶液的RLS增強強度ΔIRLS。以ΔIRLS為縱坐標,MSN的質(zhì)量濃度為橫坐標,作ΔIRLS-c標準曲線。MSN在0.005~0.16 mg/L范圍內(nèi)與ΔIRLS呈線性關(guān)系,線性方程為:ΔIRLS=-15.79+5372c,相關(guān)系數(shù)r=0.9993,檢出限為0.0046 mg/L。
準確移取1.2下的1#待測液0.30 mL、2#待測液0.20 mL、3#待測液1.00 mL,按1.3的測定方法配制溶液并同步掃描RLS光譜,各做6份平行測定。根據(jù)譜圖上RLS強度及回歸方程即可求出各待測液中MSN的含量,從而求得原始MSN樣品中MSN的含量。最后做3水平的加標回收試驗,各水平做6份平行測定,依據(jù)實驗結(jié)果即可判斷方法的準確度和精密度。結(jié)果見表1。
表1 美司那樣品分析結(jié)果及回收試驗(n=6)
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用本文建立的瑞利光散射法測定美司那,簡便、快速并有高的靈敏度(4.8 ng/L)、準確度(回收率為98.3%~102%)和精密度(RSD為1.8%~2.5%),滿足痕量分析要求。樣品處理簡單、安全,所用儀器為普通熒光分光光度計易于普及,所用試劑為一般的分析純易于采購。本方法可用于市售MSN藥物及人體血液樣品中MSN的定量分析。