劉金輝，鄭令娜，汪 冰，陳明麗，王 萌*，豐偉悅

(1.中國(guó)科學(xué)院高能物理研究所，中科院納米生物效應(yīng)與安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100049；2.東北大學(xué)理學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110819；)

1 前言

激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜(Laser Ablation-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry,LA-ICP-MS)作為一種用于直接分析固體材料中元素的分析技術(shù)[1]，自誕生以來(lái)就受到了廣泛的關(guān)注，并已經(jīng)在地質(zhì)、海洋、核工業(yè)、環(huán)境、生物、材料、法醫(yī)等科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[2 - 5]。傳統(tǒng)濕法消解的元素分析方法存在著消解過(guò)程繁瑣，易揮發(fā)元素?fù)p失，酸堿試劑消耗量大，制樣過(guò)程易受到污染等問(wèn)題。而LA-ICP-MS樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，樣品損傷小，進(jìn)樣速度快，空間分辨率高，因此LA-ICP-MS成為一種固體樣品中微量元素分析的常用技術(shù)[2,3]。

LA-ICP-MS分析技術(shù)最早由Gray提出[6]。經(jīng)歷了30多年的發(fā)展，LA-ICP-MS儀器不斷改進(jìn)：在激光剝蝕系統(tǒng)方面，新開(kāi)發(fā)的冷凍剝蝕更適合生物組織的成像分析[7]；快速洗脫樣品池可以實(shí)現(xiàn)小于10 ms的洗脫時(shí)間，降低了樣品氣溶膠的擴(kuò)散和稀釋，大大提高了分析速度和靈敏度[8,9]；近場(chǎng)技術(shù)(Near Field，NF)讓激光光斑降低到亞μm級(jí)，使得基于NF-LA-ICP-MS的單細(xì)胞元素成像成為可能[10]。在質(zhì)譜系統(tǒng)方面，隨著新一代的ICP-MS，特別是采用飛行時(shí)間(Time of flight，TOF)質(zhì)量分析器的商品化ICP-TOF-MS的出現(xiàn)，使得LA-ICP-MS系統(tǒng)具有更快的數(shù)據(jù)采集速度，能夠同時(shí)檢測(cè)更多的同位素[11]。但是由于基體效應(yīng)、元素分餾效應(yīng)的影響，準(zhǔn)確的定量分析仍是LA-ICP-MS分析的一個(gè)難點(diǎn)，限制了LA-ICP-MS進(jìn)一步地應(yīng)用和發(fā)展。本文將對(duì)基于LA-ICP-MS的生物樣品定量分析進(jìn)行總結(jié)與展望。

2 LA-ICP-MS系統(tǒng)

LA-ICP-MS系統(tǒng)主要由激光剝蝕(LA)系統(tǒng)和電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)系統(tǒng)兩部分組成，主要包括：激光系統(tǒng)、配有精密移動(dòng)平臺(tái)的樣品池、ICP-MS儀和計(jì)算機(jī)?；驹硎菍⒏吣芗す馐劢褂诠腆w樣品表面進(jìn)行剝蝕取樣，隨后使用ICP-MS儀分析產(chǎn)生的氣溶膠。為了保證分析的準(zhǔn)確度，理想的LA-ICP-MS分析需要滿足以下三個(gè)條件：一是激光剝蝕取樣具有代表性，即激光剝蝕產(chǎn)生的氣溶膠的組成與樣品組成相同；二是高的氣溶膠傳輸效率，即傳輸過(guò)程中氣溶膠損失較少；三是高的離子化效率，即氣溶膠顆粒能在等離子體中完全原子化和離子化[5]。

3 定量校正方法

LA-ICP-MS分析的誤差主要來(lái)自樣品剝蝕過(guò)程、氣溶膠傳輸過(guò)程、氣溶膠離子化過(guò)程和質(zhì)譜分析過(guò)程(圖1)[12]。LA-ICP-MS中校正的目的是減少分析過(guò)程中的誤差，使檢測(cè)信號(hào)可以更準(zhǔn)確、更真實(shí)地反映樣品中的元素信息。誤差的校正主要包括兩個(gè)部分：基體效應(yīng)和元素分餾效應(yīng)的校正。

圖1 LA-ICP-MS分析中的誤差來(lái)源[12]Fig.1 Sources of error in LA-ICP-MS analysis[12]

基體效應(yīng)是指基體對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響，可分為基體組成效應(yīng)(基體元素的濃度和形態(tài)等)與物理結(jié)構(gòu)效應(yīng)(如玻璃態(tài)與結(jié)晶態(tài))[13]。由于很難找到完全基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)參考物，實(shí)際分析中常常選用合適的內(nèi)標(biāo)元素來(lái)補(bǔ)償基體效應(yīng)[14]。分餾效應(yīng)是由于樣品中不同元素在剝蝕、傳輸和離子化過(guò)程中存在差異，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果與樣品實(shí)際組成有一定差異[5,15]。樣品中的易揮發(fā)性元素在剝蝕產(chǎn)生的氣溶膠中被富集，從而導(dǎo)致非化學(xué)計(jì)量取樣和分析[16]。如激光波長(zhǎng)是影響元素分餾效應(yīng)的一個(gè)重要因素，使用更短的激光波長(zhǎng)能有效減少分餾效應(yīng)；使用He作為載氣也可以減小分餾效應(yīng)，提高分析結(jié)果的可靠性[17 - 19]。

目前生物樣品的LA-ICP-MS分析主要采用基體匹配外標(biāo)校正法和同位素稀釋法兩種方法。

3.1 基體匹配外標(biāo)校正法

基體匹配外標(biāo)校正法需要使用與待測(cè)樣品基體匹配的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Certified Reference Materials,CRM)。如果樣品與CRM基體匹配，那么兩者的激光剝蝕、氣溶膠傳輸、離子化等過(guò)程被認(rèn)為是基本相同的，從而得到可靠的分析結(jié)果。但是目前只少數(shù)幾類商品化的CRM(如玻璃)，而缺乏應(yīng)用于LA-ICP-MS生物分析的CRM。為了解決上述問(wèn)題，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室自行制備了基質(zhì)匹配的生物標(biāo)準(zhǔn)樣品，其制備過(guò)程主要包括勻漿、元素加標(biāo)、冷凍、低溫切割和固化等[3]，主要流程如圖2所示。目前文獻(xiàn)中已有使用鼠腦[20]、雞胸肉[21]、蛋黃[22]等制備基體匹配標(biāo)準(zhǔn)并成功用于生物樣品中微量元素定量的報(bào)道。使用生物組織作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)在于，標(biāo)準(zhǔn)與樣品基體相近，可以有效減小基體效應(yīng)和分餾效應(yīng)的影響。

圖2 組織標(biāo)準(zhǔn)合成的工作流程Fig.2 Schematic workflow for standard tissue synthesis

除了使用生物組織以外，還可以使用天然或人工合成的高分子材料制作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。Austin等用旋涂的方法制備了含有已知濃度的系列聚甲基丙烯酸甲酯薄膜(PMMA)，成功定量分析了生物切片[23]。Stark等使用加標(biāo)的瓊脂糖薄膜作為L(zhǎng)A-ICP-MS定量標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)金屬元素的準(zhǔn)確定量[24]。Cruz-Alonso等使用實(shí)驗(yàn)室制備的眀膠標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)阿爾茨海默病患者腦中的含鐵蛋白進(jìn)行了定量成像[25]。此類方法的優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，具有很好的實(shí)用價(jià)值。

在使用基體匹配外標(biāo)法定量時(shí)，可以同時(shí)使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正。合適的內(nèi)標(biāo)可以校正激光輸入功率、樣品剝蝕量等差別，得到更加可靠的分析結(jié)果。選擇的內(nèi)標(biāo)元素需要在樣品中均勻分布，并且內(nèi)標(biāo)元素與分析元素在LA-ICP-MS分析過(guò)程中的物理化學(xué)行為近似。碳元素在生物組織中廣泛分布，常常作為內(nèi)標(biāo)校正元素。此外，硫元素也可以作為分析某些生物樣品(如頭發(fā))的內(nèi)標(biāo)校正元素[26]。

3.2 同位素稀釋法

在應(yīng)用同位素稀釋法(Isotope Dilution,ID)時(shí)，首先向樣品中加入已知豐度和質(zhì)量的同位素稀釋劑，達(dá)到同位素平衡后，再通過(guò)分析同位素比的變化得到樣品中元素含量[27]。同位素稀釋法可以直接溯源到國(guó)際單位制，是一種權(quán)威的化學(xué)計(jì)量方法。但是對(duì)于LA-ICP-MS分析來(lái)說(shuō)，同位素稀釋劑很難直接添加到生物樣品中并實(shí)現(xiàn)同位素平衡[28]。

為了將同位素稀釋劑均勻地添加到生物樣品中，Thieleke等利用含有同位素稀釋劑的聚合物薄膜(5～10 μm)對(duì)生物樣品中的微量元素進(jìn)行了定量，為L(zhǎng)A-ICP-MS的準(zhǔn)確定量提供了一種可選擇的方案[29]。Feng等利用免疫組化筆勾勒鼠腦切片的輪廓，保證添加的同位素稀釋劑均勻分布在切片范圍內(nèi)，通過(guò)稱量法得到添加同位素稀釋劑質(zhì)量，得到了鼠腦切片中Cu、Zn、Fe定量成像[30]。Moraleja等利用商品化的噴墨打印機(jī)，在小鼠腎臟切片上均勻打印同位素稀釋劑，實(shí)現(xiàn)了同位素稀釋劑與生物切片的原位混合，通過(guò)LA-ICP-MS得到了鉑類抗癌藥物在小鼠腎臟中的分布[31]。

除了上述在樣品制備過(guò)程中添加同位素稀釋外，還可以在線引入同位素稀釋劑。在這種校準(zhǔn)方法中，激光剝蝕產(chǎn)生的固體氣溶膠與來(lái)自同位素稀釋劑的液體氣溶膠混合，進(jìn)入進(jìn)ICP-MS儀完成分析，因而無(wú)需繁瑣前處理過(guò)程就可以實(shí)現(xiàn)組織切片等生物樣品的原位定量分析[32,33]。在線引入同位素稀釋劑存在的問(wèn)題是兩種氣溶膠很難混合均勻，可能導(dǎo)致同位素比值測(cè)定不準(zhǔn)確。為了提高氣溶膠混合效率，達(dá)到良好的同位素平衡，F(xiàn)eng等比較了4種不同的在線同位素稀釋劑混合裝置，綜合評(píng)價(jià)了裝置的混合效率[34]。

4 應(yīng)用

目前地球科學(xué)仍然是LA-ICP-MS的主要應(yīng)用領(lǐng)域，但近年來(lái)LA-ICP-MS在生物分析領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣的應(yīng)用。本文將簡(jiǎn)述LA-ICP-MS在單細(xì)胞分析，生物元素成像、生物分子成像等方面的應(yīng)用。

4.1 單細(xì)胞分析

傳統(tǒng)分析細(xì)胞中微量元素的方法(如消解后用ICP-MS法檢測(cè))，只能獲得細(xì)胞群體中元素的平均含量，并不能得到單個(gè)細(xì)胞的元素含量，無(wú)法研究元素在細(xì)胞間的差異。LA-ICP-MS法被認(rèn)為是一種很有潛力的單細(xì)胞原位分析方法[35,36]，但目前分析方法的主要困難在于缺乏單細(xì)胞的定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

Drescher等用移液器在硝基纖維薄膜上制備金屬納米顆粒液滴(～0.5 μL)，作為基體匹配標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)了LA-ICP-MS法對(duì)單細(xì)胞中金屬納米顆粒的定量分析[37]。但是用移液器制備的液滴(μL量級(jí))與細(xì)胞(pL量級(jí))的體積有巨大的差別，在一定程度上影響了結(jié)果的可靠性。Wang等使用噴墨打印機(jī)制備了與細(xì)胞大小和含碳量相似的標(biāo)準(zhǔn)溶液液滴，作為基體匹配的單細(xì)胞外部定量標(biāo)準(zhǔn)，利用LA-ICP-MS法定量分析了載玻片上單細(xì)胞中的金納米顆粒[38]。Stigin等采用微流控技術(shù)制備了含有不同濃度Cu的明膠微陣列作為外部標(biāo)準(zhǔn)，采用LA-ICP-MS法定量分析了單個(gè)海螺細(xì)胞中的Cu，并用同步輻射X射線熒光法驗(yàn)證了LA-ICP-MS法的結(jié)果[39]。

為了提高LA-ICP-MS的單細(xì)胞分析通量，Zheng等使用微加工技術(shù)制備了用于捕獲細(xì)胞的微孔陣列，得到了整齊排列的人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)單細(xì)胞陣列，因此可以采用網(wǎng)格方式剝蝕陣列中的單細(xì)胞，從而提高了LA-ICP-MS單細(xì)胞的分析通量(圖3)[40]。

圖3 LA-ICP-MS分析單細(xì)胞陣列[40]Fig.3 Analysis of single cells in array by LA-ICP-MS[40]

4.2 生物元素成像

微量元素在生物體內(nèi)含量雖然很低，卻起著至關(guān)重要的作用。例如微量元素作為蛋白質(zhì)的活性中心或結(jié)構(gòu)中心，參與了生物體內(nèi)的許多重要化學(xué)反應(yīng)[41]。微量元素還與一些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[42]。因此，生物元素的原位分析，無(wú)論是對(duì)于研究微量元素在生物體內(nèi)的結(jié)構(gòu)、功能和生物效應(yīng)，還是對(duì)于闡明與微量元素相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理，尋找這些疾病的預(yù)防和治療策略，都具有重要的意義[43,44]。LA-ICP-MS法最近越來(lái)越多地應(yīng)用于生物元素成像分析，表1列舉其中部分應(yīng)用實(shí)例。

表1 LA-ICP-MS生物元素成像的部分應(yīng)用

4.3 生物分子成像

LA-ICP-MS技術(shù)與免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)生物切片中分子成像分析。首先使用元素標(biāo)記的抗體特異性識(shí)別切片上的待測(cè)分子(抗原)，然后通過(guò)LA-ICP-MS法分析標(biāo)記的元素得到待測(cè)分子的成像圖。利用上述方法，Seuma等成功得到了兩種癌癥生物標(biāo)志分子在組織上的成像，進(jìn)一步拓展了LA-ICP-MS 的應(yīng)用范圍[57]。

最近出現(xiàn)的基于TOF技術(shù)的ICP-MS儀(即流式質(zhì)譜儀，Mass Cytometry)，被認(rèn)為可能成為下一代單細(xì)胞分析的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)[58,59]。由于使用TOF質(zhì)量分析器，流式質(zhì)譜儀具有很快的掃描速度，可以瞬時(shí)檢測(cè)信號(hào)中的多個(gè)元素，大大提高了元素成像的速度。Giesen等將流式質(zhì)譜儀與激光剝蝕系統(tǒng)聯(lián)用，使用金屬標(biāo)記抗體，在亞細(xì)胞水平上對(duì)乳腺癌組織切片的32種蛋白同時(shí)完成了免疫成像分析[60]。雖然基于LA-ICP-MS法的免疫分子成像技術(shù)還處于早期發(fā)展階段，但已經(jīng)表現(xiàn)出了強(qiáng)大的分析能力，有望在腫瘤微環(huán)境研究、免疫診療等領(lǐng)域中得到進(jìn)一步應(yīng)用[61]。

5 總結(jié)與展望

檢出限好、動(dòng)態(tài)范圍寬、空間分辨率高等優(yōu)點(diǎn)讓LA-ICP-MS成為直接分析固體樣品中元素的有力工具。近年來(lái)，隨著激光器、樣品池、質(zhì)量分析器等儀器硬件的快速發(fā)展，同時(shí)隨著分析方法，特別是定量方法的不斷進(jìn)步，LA-ICP-MS法開(kāi)始越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究。

在最近的文獻(xiàn)報(bào)道中，有幾個(gè)趨勢(shì)值得關(guān)注：首先，LA-ICP-MS分析空間分辨率不斷提高，達(dá)到亞微米的水平，這使得在單細(xì)胞的元素成像成為了可能；其次，LA-ICP-MS的分析速度提高，可以分析整體動(dòng)物切片，并可以通過(guò)三維重構(gòu)連續(xù)切片的元素成像圖，得到元素在樣品中三維立體分布；最后，LA-ICP-MS與其他多種生物技術(shù)或檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)用，可以研究以前單一技術(shù)難以完成的科學(xué)問(wèn)題。比如近年來(lái)研究人員把LA-ICP-MS技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)同一切片中幾十種蛋白分子的成像和半定量分析。儀器硬件和分析方法的緊密結(jié)合和相互促進(jìn)，必將推動(dòng)LA-ICP-MS法在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域更廣泛的應(yīng)用，取得更多的突破性成果。