李獻(xiàn)銳，王 娜，王貝貝，籍雪平*，劉學(xué)鋒

(1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北石家莊 050017)

環(huán)丙氨嗪(Cyromazine，CYR)又名滅蠅胺，它是一種三嗪類(lèi)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可以抑制雙翅目及部分鞘翅目昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育和羽化[1,2]，被廣泛添加到動(dòng)物飼料中以控制動(dòng)物廄舍內(nèi)蠅蛆的生長(zhǎng)發(fā)育。然而毒理學(xué)研究證明，環(huán)丙氨嗪能導(dǎo)致動(dòng)物的乳房腫瘤，其代謝產(chǎn)物三聚氰胺能夠引起膀胱腫瘤[3]。若環(huán)丙氨嗪長(zhǎng)期被用做飼料添加劑，容易導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中藥物殘留超標(biāo)，影響人民身體健康[4]。世界各國(guó)均制定了嚴(yán)格的飼料添加濃度和畜產(chǎn)品中的最高殘留限量[3,5,6]。有關(guān)環(huán)丙氨嗪的分析方法有熒光法[2]側(cè)流免疫層析法[3]、高效液相色譜法[4,7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8,9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10]、核磁共振法[11]等。

流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法因其具有儀器簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、靈敏度高及干擾小等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在藥物分析、生化分析等領(lǐng)域的應(yīng)用日趨活躍[12]。唐曉爽等[13]和丁彥庭等[14]利用流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法測(cè)定了奶粉中的三聚氰胺，而用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定環(huán)丙氨嗪含量的方法未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究了環(huán)丙氨嗪對(duì)K3[Fe(CN)6]-魯米諾體系化學(xué)發(fā)光行為的影響。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙氨嗪可使該體系發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)，結(jié)合流動(dòng)注射技術(shù)，建立了一種簡(jiǎn)單、靈敏的測(cè)定環(huán)丙氨嗪的新方法，并應(yīng)用于飼料中環(huán)丙氨嗪的分析測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

IFFS-A型多功能化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(西安瑞邁公司)；IFFM-E型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁公司)；F-7000型熒光分光光度計(jì)(日本，日立公司)；TU-1901型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用公司)；微型高速離心機(jī)(Sigma公司)。

環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100.0 mg/L)：稱(chēng)取10.00 mg環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)品(阿拉丁公司)，用適量水溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，貯存于4 ℃冰箱中，使用時(shí)用水稀釋到所需濃度。魯米諾儲(chǔ)備溶液(1.0×10-2mol/L)：稱(chēng)取0.1772 g魯米諾(阿拉丁公司)，用0.10 mol/L的NaOH溶液溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，使用時(shí)用0.03 mol/L NaOH溶液稀釋。K3[Fe(CN)6]儲(chǔ)備溶液：2.0×10-3mol/L，使用時(shí)用水稀釋。所用試劑均為分析純，水為超純水(18 MΩ·cm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光(FI-CL)流程如圖1所示。魯米諾堿性溶液與K3[Fe(CN)6]溶液經(jīng)過(guò)三通管混合后載入流路，待基線(xiàn)穩(wěn)定后，通過(guò)進(jìn)樣閥將環(huán)丙氨嗪溶液注入到魯米諾與K3[Fe(CN)6]的混合液流中，發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。記錄化學(xué)發(fā)光信號(hào)，以峰高定量。

圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of FI-CL system

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2000 g待測(cè)樣品于小燒杯中，依次加入5 mL 1%三氯乙酸溶液和2 mL 2%Pb(Ac)2溶液，搖勻。將混合液以4 000 r/min離心5 min，吸取上清液，重復(fù)提取2次。將上清液合并，并以5 000 r/min離心5 min 后，取上清液5 mL，氮吹儀吹干后用水溶解，定容至100 mL即得樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

采用靜態(tài)注射的方式考察了K3[Fe(CN)6]-魯米諾-環(huán)丙氨嗪發(fā)光體系的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(圖2)。由動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)，從試劑混合到發(fā)光信號(hào)達(dá)到最大值大約需2～3 s的時(shí)間，隨后化學(xué)發(fā)光信號(hào)逐漸降低回到基線(xiàn)，說(shuō)明K3[Fe(CN)6]氧化魯米諾的反應(yīng)為快發(fā)光反應(yīng)。將50 μL 100.0 mg/L的環(huán)丙氨嗪注入5 mL 的K3[Fe(CN)6]-魯米諾體系中，發(fā)光強(qiáng)度由原來(lái)的2 900增加到7 500，表明環(huán)丙氨嗪對(duì)K3[Fe(CN)6]-魯米諾體系的化學(xué)發(fā)光具有增敏作用。

圖2 化學(xué)發(fā)光的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)Fig.2 Kinetic curve of chemiluminescence reactiona.luminol-K3[Fe(CN)6]；b.CYR-luminol-K3[Fe(CN)6].cluminol:1.0×10-5 mol/L,c(K3[Fe(CN)6]):2.0×10-5 mol/L,cCYR:1.0 mg/L.

2.2 流路參數(shù)的選擇

在其它實(shí)驗(yàn)條件確定的情況下，分別考察了光電倍增管的負(fù)高壓、混合管長(zhǎng)度和試劑流速對(duì)信噪比的影響。結(jié)果表明，在光電倍增管的負(fù)高壓為-650 V、混合管長(zhǎng)度為10 cm、進(jìn)樣體積為100 μL和蠕動(dòng)泵泵速在30 r/min時(shí)具有最佳的信噪比。

2.3 化學(xué)發(fā)光條件的優(yōu)化

2.3.1 魯米諾堿性介質(zhì)的選擇魯米諾在堿性條件下容易被氧化。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了同一濃度NaOH、Na2CO3、NaHCO3三種堿性介質(zhì)對(duì)K3[Fe(CN)6]-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系的影響，發(fā)現(xiàn)在NaOH溶液中，環(huán)丙氨嗪對(duì)該發(fā)光體系具有最顯著的增敏效果。因此選擇NaOH作為堿性介質(zhì)。

考察了不同濃度NaOH(0.005～0.2 mol/L)的影響。結(jié)果顯示，隨著其濃度的增大，發(fā)光信號(hào)先增強(qiáng)后減弱，但噪聲也隨之增大，根據(jù)最佳信噪比，確定NaOH的最佳濃度為0.03 mol/L。

2.3.2 魯米諾濃度的選擇發(fā)光強(qiáng)度的大小依賴(lài)于發(fā)光試劑的濃度?？疾炝唆斆字Z濃度在1.0×10-8～5.0×10-5mol/L范圍內(nèi)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(圖3)，魯米諾濃度從1.0×10-8增大至1.0×10-5mol/L，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),但1.0×10-5mol/L以后相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度增大不太明顯。因此優(yōu)化魯米諾溶液的濃度為1.0×10-5mol/L。

圖3 魯米諾濃度對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(ΔI)的影響Fig.3 Effect of luminol concentration on ΔI2.0×10-5 mol/L K3[Fe(CN)6] + 0.10 mg/L CYR+ luminol from top to bottom(c luminol /10-6 mol/L):50,30,20,10,5,2,1,0.5,0.2.

2.3.3 K3[Fe(CN)6]濃度的選擇考察了5.0×10-6～2.0×10-4mol/L濃度范圍內(nèi)的K3[Fe(CN)6]對(duì)光強(qiáng)的影響。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)K3[Fe(CN)6]濃度為2.0×10-5mol/L時(shí)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大值。超過(guò)2.0×10-5mol/L發(fā)光信號(hào)有所降低，因此確定K3[Fe(CN)6]的最佳濃度為2.0×10-5mol/L。

圖4 K3[Fe(CN)6]濃度對(duì)相對(duì)發(fā)光信號(hào)的影響Fig.4 Effect of K3[Fe(CN)6] concentration on ΔI1.0×10-5 mol/L luminol+0.10 mg/L CYR+K3[Fe(CN)6] from top to bottom(c(K3[Fe(CN)6])/10-5 mol/L):20,15,10,5,2,1,0.5,0.2,0.1.

2.4 線(xiàn)性范圍、靈敏度和檢出限

在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，環(huán)丙氨嗪在0.05～8.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)與體系的發(fā)光信號(hào)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為：ΔI=362.8c+10.68，r=0.9991，檢出限為3.1×10-2mg/L。在最優(yōu)條件下對(duì)1.50 mg/L的環(huán)丙氨嗪連續(xù)進(jìn)行平行測(cè)定11次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.9%。

2.5 干擾試驗(yàn)

在環(huán)丙氨嗪濃度為3.0 mg/L，相對(duì)誤差±5%的條件下，研究了可能共存的物質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾情況。結(jié)果表明，1 000倍的K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Cl-，100倍的淀粉、糊精不干擾測(cè)定。

2.6 樣品測(cè)定

將3份飼料樣品按“1.3”方法處理，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，并做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 飼料中環(huán)丙氨嗪的含量測(cè)定及回收率

2.7 反應(yīng)機(jī)理探討

為了探究可能的反應(yīng)機(jī)理，掃描了體系中不同混合溶液的紫外吸收光譜(圖5)和化學(xué)發(fā)光光譜(圖6)。紫外-可見(jiàn)吸收光譜中環(huán)丙胺嗪在250 nm之外沒(méi)有吸收，K3[Fe(CN)6]和魯米諾混合溶液在加入環(huán)丙胺嗪前后體系的特征吸收峰沒(méi)有變化，只是峰高有所增加。說(shuō)明反應(yīng)前后沒(méi)有新物質(zhì)生成，環(huán)丙胺嗪只起到催化作用。從化學(xué)發(fā)光圖譜可以看到，K3[Fe(CN)6]-魯米諾和K3[Fe(CN)6]-魯米諾-CYR體系的最大發(fā)光波長(zhǎng)都是425 nm，表明兩個(gè)體系的發(fā)光物質(zhì)相同，都是3-aminophthalate[15]。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)通氮除氧，會(huì)降低增敏效果，說(shuō)明環(huán)丙胺嗪的增敏效果和溶解氧有關(guān)。

圖5 紫外-可見(jiàn)(UV-Vis)吸收光譜圖Fig.5 UV-Vis absorption spectrum of CL systema.cyromazine;b.K3[Fe(CN)6]-luminol；c.K3[Fe(CN)6]-luminol-cyromazine.

圖6 化學(xué)發(fā)光光譜圖Fig.6 Luminescence spectrum a.K3[Fe(CN)6]-luminol;b.K3[Fe(CN)6]-luminol-cyromazine.

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，環(huán)丙胺嗪對(duì)K3[Fe(CN)6]-魯米諾發(fā)光體系的增敏機(jī)理可推測(cè)如下：

3 結(jié)論

基于在堿性條件下，環(huán)丙氨嗪對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀體系發(fā)光反應(yīng)具有明顯的增敏作用，建立了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光測(cè)定環(huán)丙氨嗪的分析方法，并應(yīng)用于動(dòng)物飼料中的測(cè)定，取得了令人滿(mǎn)意的結(jié)果。