鐘艷琴，史 瑩，王丹琪，肖 雙

(1.長沙醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南長沙 410205；2.四川省食品安全監(jiān)測與風(fēng)險(xiǎn)評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川成都 610041)

荷葉堿來源于荷葉，是一種阿樸啡型生物堿，是荷葉中的主要降脂活性成分[1]；大黃、番瀉葉、何首烏及決明子等中草藥中均含有大黃蒽醌類化合物。這些中藥在中國藥典(2015版)[2]中都有明確的每日用量限制。蒽醌類化合物主要為大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素及大黃素甲醚，蒽醌類化合物也屬于瀉藥中的一種，長期服用含這些蒽醌類化合物的保健品，也會引起大腸黑便病，增加肝毒性，甚至致畸和致癌[3]。因此，建立一種快速檢測減肥保健食品中是否含有這些功效成分及蒽醌類化合物的含量的方法是十分必要的。

目前，對上述化合物單獨(dú)測定或某一類型同時(shí)測定方法較多，主要有液相色譜法[4,5]、液質(zhì)聯(lián)用法[6 - 8]及毛細(xì)管電泳[9,10]等方法，但同時(shí)測定這6種功效成分的方法在國內(nèi)外尚未見到。本文建立的是一種高效液相色譜同時(shí)測定減肥保健食品中的荷葉堿、大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素甲醚6種成分的分析方法，為減肥類保健食品有效成分及質(zhì)量缺陷的初篩提供技術(shù)保障。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國，安捷倫)；KQ-250超聲清洗器(昆山市淀山湖檢測儀器廠)；TGL-16B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；BSA224S分析天平(東莞康潤儀器設(shè)備有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和荷葉堿(純度均≥98.0%，成都曼斯特生物科技有限公司)；甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司)；H3PO4(分析純，長沙晶康新材料科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)物溶解于純甲醇，其濃度分別為：蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚(50 μg/mL)，大黃素甲醚(40 μg/mL)，荷葉堿(100 μg/mL)。所有溶液于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品前處理

減肥茶及片劑樣品經(jīng)研磨混勻，減肥膠囊和軟膠囊去殼后混勻，準(zhǔn)確稱取該樣品0.1 g于8 mL 70%乙醇-水溶液中，超聲提取30 min后，用70%乙醇-水溶液補(bǔ)充到10 mL，混勻后取1 mL該溶液于離心機(jī)上13 000 r/min離心5 min，上清液進(jìn)樣分析，每種樣品做平行樣。

1.4 色譜條件

菲羅門-Luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇(A)和0.02%H3PO4水溶液(B)(pH=2.3)。梯度洗脫條件為：0～4 min，69%A；4～20 min，69%～90%A；20～27 min，90%A；28 min，90%～69%A。流速為0.8 ml/mim，柱溫25 ℃，20 μL進(jìn)樣分析，檢測波長254 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

根據(jù)待測物的性質(zhì)及在參考文獻(xiàn)報(bào)道[11 - 15]的基礎(chǔ)上，分別比較了不同的提取溶劑，結(jié)果表明6種待測物在70%甲醇與70%乙醇兩種提取劑中提取效率相當(dāng)，因而選擇70%乙醇作為提取溶液。比較了不同超聲提取時(shí)間(15～90 min)對6種目標(biāo)物提取效率的影響。結(jié)果表明隨著提取時(shí)間的增加，提取效率也逐漸的增加，當(dāng)達(dá)到30 min時(shí)6種待測物的提取基本上達(dá)到平衡。故本研究選擇的提取條件為70%乙醇-水溶液，超聲提取30 min。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 波長的選擇將各種標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行紫外-可見波長掃描，從光譜圖得出大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和荷葉堿均在254 nm有較大的吸收，故選擇254 nm作為檢測波長，標(biāo)準(zhǔn)色譜圖如圖1所示。

圖1 6種標(biāo)準(zhǔn)物的色譜圖Fig.1 Chromatograms of the standard mixture of 6 compoundsPeak identifications:1.nuciferine(7.92 min);2.aloe-emodin(12.71 min);3.rhein(15.87 min);4.emodin(21.51 min);5.chrysophanol(23.35 min);6.physcion(26.39 min).

2.2.2 流動相中磷酸濃度的優(yōu)化考察了不同H3PO4濃度(0.00%～0.50%)對分離的影響。當(dāng)流動相體系僅為甲醇-水，蘆薈大黃素與大黃酸不能完全分離，且荷葉堿的峰為平頭峰；隨著H3PO4濃度的增加，荷葉堿的峰形逐漸變好、出峰時(shí)間變短，而其它5種物質(zhì)基本上保持不變。當(dāng)H3PO4濃度為0.02%，各種物質(zhì)的分離度Rs在1.5以上，且峰形尖銳對稱。因此最終選擇甲醇-0.02%H3PO4溶液為流動相。

2.2.3 溫度的選擇在流動相確定的情況下，比較了不同溫度(20 ℃～50 ℃)對6種物質(zhì)分離的影響，研究表明隨著溫度的升高各種物質(zhì)出峰時(shí)間均變短，荷葉堿的峰形也逐漸的變好，而基線噪聲也逐漸增大。綜合考慮各種物質(zhì)的分離度及峰形選擇25 ℃為本研究的柱溫。

2.2.4 流速的選擇試驗(yàn)了不同流速(0.4～1.0 mL/min)對目標(biāo)物分離的影響，得出隨著流速的增加各種目標(biāo)物出峰時(shí)間均縮短，且峰形也逐漸變好，但峰面積逐漸降低。綜合考慮本文的流速選為0.8 mL/min。

2.2.5 進(jìn)樣量的優(yōu)化考察了不同進(jìn)樣量(3、5、10、15、20 μL)對峰形及峰面積的影響，各種物質(zhì)的峰面積隨著進(jìn)樣體積的增加而增加。峰面積和峰形在進(jìn)樣量20 μL均滿足條件，故選擇20 μL作為進(jìn)樣量。

2.3 方法性能指標(biāo)

2.3.1 線性范圍、檢出限及定量限在優(yōu)化色譜條件下，以各化合物峰面積(y)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1列出了各化合物的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限以及定量限。

表1 化合物的線性范圍、檢出限(LOD)及定量限(LOQ)

2.3.2 方法精密度與準(zhǔn)確度向某一粉劑樣品中分別加入(低、中、高)三個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用1.3方法處理后，同天內(nèi)重復(fù)測定6次以及連續(xù)6 d測定，如表2所示，各種目標(biāo)化合物的日內(nèi)精密度為0.79%～6.3%，日間精密度為0.90%～8.1%，加標(biāo)回收率為62.5%～115.0%。

表2 方法的精密度與準(zhǔn)確度

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)選擇在某一膠囊樣品中加入(低、中、高)3種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用來評價(jià)該方法的基質(zhì)效應(yīng)，該樣品中的基質(zhì)效應(yīng)在79.5%～107.5%之間，可以忽略[16]。

2.4 樣品分析

應(yīng)用本法對隨機(jī)從藥店購買的8種樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行了測定，結(jié)果如表3所示。從表3中可見在8種減肥類保健品中均檢測出大黃類化合物，其中2種樣品中同時(shí)檢測出荷葉堿與大黃類化合物。

表3 8樣品中6種物質(zhì)檢測的結(jié)果

3 結(jié)論

建立了同時(shí)測定減肥類保健食品中6種功效成分(荷葉堿、大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素甲醚)的高效液相色譜法。方法精密度和加標(biāo)回收率等性能指標(biāo)良好，且樣品處理方法簡單，并成功應(yīng)用到不同劑型(茶、片劑、膠囊、軟膠囊)樣品的分析測定。