陳倩倩，顧翔源，楊澤怡，張 瑞，陸姍姍，朱穎越

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500)

砷屬于過渡性元素，單質(zhì)砷毒性很小，但砷化物均有毒性[1]。砷和砷化物主要應(yīng)用于合金材料、半導(dǎo)體材料，木材防腐劑、殺蟲劑、除草劑，醫(yī)藥領(lǐng)域。砷及其化合物主要以食物、空氣和飲用水等方式進入人體，且常以As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的形態(tài)存在于地下水中[2]，而As(Ⅲ)的毒性最強[3,4]。由于砷在體內(nèi)代謝較慢，長時間蓄積在體內(nèi)會引起各個器官和系統(tǒng)的異常和病變[5]，且有機砷會破壞人體DNA，并引發(fā)癌癥[6，7]。因此，對檢測As(Ⅲ)新方法的研究具有重要的現(xiàn)實意義。

目前檢測砷的方法主要有銀鹽法、砷斑法、原子熒光光譜法[8]、原子吸收光譜法[9]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[10]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[11，12]等。上述方法都有很高的靈敏性和準確性，但是所需儀器昂貴，檢測過程繁瑣、成本高，前處理過程時間較長，不適用于現(xiàn)場快速檢測。所以研究一種簡便高效、精密度高的檢測As(Ⅲ)的方法具有很大前景。

近年來，有不少研究表明，基于核酸適配體的生物傳感技術(shù)對As(Ⅲ)具有良好的檢測效果，其作為一種新型檢測方法具有簡單快捷、成本低、親和力高、特異性強等優(yōu)點[13,14]。本文基于鹽誘導(dǎo)下核酸適配體與銀納米粒子(AgNPs)相互作用，通過研究其特定波長下吸光度的比值A(chǔ)650/A420與As(Ⅲ)濃度的變化關(guān)系實現(xiàn)對As(Ⅲ)的檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

旋渦振蕩器(美國，Scientific Industries公司)；密理博超純水儀(北京普析通用公司)；Lambda 25紫外-可見分光光度計(美國，Perkin Elmer公司)；磁力加熱攪拌機(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

As(Ⅲ)、Cu(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)的標準液均購自于國家標準物質(zhì)中心；核酸適配體序列為：5′-TTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCG-3′，購于上海生工公司；AgNO3、二水合檸檬酸三鈉、NaCl、三羥甲基氨基甲烷(Tris)均為分析純，購買于江蘇強盛功能化工股份有限公司。實驗用水為超純水(>18 MΩ·cm)。

1.2 銀納米粒子的合成

將100 mL超純水配制的0.01%AgNO3溶液裝入錐形瓶中，加入磁力攪拌子，置于恒溫電磁攪拌器上加熱，沸騰持續(xù)2 min后迅速加入2.5 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)攪拌加熱至溶液變?yōu)榈S色，生成銀納米粒子(AgNPs)，繼續(xù)加熱10 min后停止加熱，攪拌使其冷卻至室溫，放置在4 ℃環(huán)境中貯存，備用。

1.3 實驗原理

銀納米粒子在鹽誘導(dǎo)下會發(fā)生聚集，引起體系吸光度有明顯的改變。體系中的NaCl與核酸適配體在一定條件下能維持平衡時，吸光度保持不變。原理如圖1所示，當(dāng)不存在As(Ⅲ)時，核酸適配體吸附包裹在AgNPs表面，性質(zhì)穩(wěn)定，在鹽溶液中呈分散狀態(tài)，溶液顏色為黃色[15]；當(dāng)存在As(Ⅲ)時，核酸適配體從AgNPs上脫離下來，與As(Ⅲ)結(jié)合形成復(fù)雜的配合物，使AgNPs暴露在鹽環(huán)境中[16]，從而導(dǎo)致AgNPs聚集，溶液顏色由黃色變?yōu)榛疑?，吸光度和特征峰位置均發(fā)生改變?；诖嗽斫⒌男滦蜕飩鞲衅骺蓪崿F(xiàn)對As(Ⅲ)的快速檢測。

圖1 比色傳感器檢測As(Ⅲ)原理圖Fig.1 Schematic illustration of the colorimetric sensor for As(Ⅲ)

1.4 實驗方法

向2 mL離心管中，先加入500 μL的AgNPs溶液，再加入30 μL用緩沖液(20 mmol/L的Thris-HCl,pH=7.4)配制好的核酸溶液，使其最終體系濃度為1.5 nmol/L，然后在45 ℃恒溫水浴加熱3 min后，加入65 μL NaCl溶液，使其最終體系濃度為32.5 mmol/L，其次加入一系列不同濃度的As(Ⅲ)溶液，最后用超純水定容至2 mL?；靹蛘袷幒?，反應(yīng)10 min，用紫外-可見分光光度計，在波長300～700 nm范圍進行光譜掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

本實驗是利用NaCl、As(Ⅲ)與核酸適配體的競爭關(guān)系實現(xiàn)對AgNPs的可控聚集，所以NaCl和核酸適配體的量直接影響整個檢測體系的性能。由圖2(a)可知，AgNPs在分散狀態(tài)下于420 nm有最大吸收峰，聚集狀態(tài)下于650 nm有最大吸收峰，所以用A650/A420反映AgNPs從分散到聚集的變化情況。從圖中可以看到，當(dāng)NaCl濃度為32.5 mmol/L時，A650/A420比值最大，AgNPs聚集程度最大，NaCl濃度再增加時，A650/A420比值不變，故選擇NaCl的最佳濃度為32.5 mmol/L；同理，當(dāng)核酸濃度為1.5 nmol/L時，A650/A420比值最小，AgNPs分散程度最大，故選擇核酸最佳濃度為1.5 nmol/L。

圖2 實驗參數(shù)濃度優(yōu)化Fig.2 Optimization of the relevant experimental factors

2.2 As(Ⅲ)砷標準曲線的建立

在實驗優(yōu)化好的條件下，在該體系加入一系列不同濃度梯度的As(Ⅲ)溶液，用紫外-可見分光光度計進行光譜掃描，以A650/A420比值和As(Ⅲ)濃度建立標準曲線。由于As(Ⅲ)與其適配體之間的結(jié)合力大于核酸適配體與AgNPs表面的電荷吸附效應(yīng)，所以隨著As(Ⅲ)濃度的增加，AgNPs會暴露在鹽環(huán)境中，聚集程度越來越明顯，A650/A420比值也越來越大，溶液顏色由棕黃色變?yōu)榈S色。由圖3可知，As(Ⅲ)濃度在5～100 ng/mL范圍內(nèi)與A650/A420比值呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：Y=0.20702+0.00705X，相關(guān)系數(shù)R2=0.9937，檢測限可達4 ng/mL。

圖3 AgNPs隨As(Ⅲ)濃度變化的吸收光譜Fig.3 Absorption spectrum of silver nanoparticles varying with As(Ⅲ) concentration(Inset:culibration of As(Ⅲ)

2.3 特異性分析

為檢測該方法的特異性，在體系中加入濃度為100 ng/mL的不同金屬離子Cu(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)，進行光譜掃描并觀察顏色變化。如圖4所示，通過分析比較，As(Ⅲ)使整個體系顏色變化最明顯，由棕黃色變?yōu)榈S色，且A650/A420比值最大，其他體系顏色變化均不明顯，表明此方法對As(Ⅲ)有良好的識別能力。

圖4 特異性分析Fig.4 Specificity analysis of the proposed method

2.4 實際樣品的檢測

為了證實該檢測方法的可行性，在自來水水樣中進行加標回收率測試。向自來水中分別加入10、20、50 ng/mL的As(Ⅲ)標準溶液，用建立的比色傳感器檢測其中的As(Ⅲ)濃度，回收率在83.31%～96.47%之間(表1)。此檢測方法可用于實際樣品的檢測。

表1 樣品回收率測定結(jié)果

3 結(jié)論

基于銀納米粒子在鹽誘導(dǎo)下發(fā)生聚集而建立的新型生物傳感器，應(yīng)用于As(Ⅲ)的快速檢測，檢測限可達4 ng/mL。本法與傳統(tǒng)方法比較具有簡單方便、快速、成本低、特異性強等優(yōu)點。通過對實際樣品的檢測，說明此方法具有一定的實用性和可靠性，應(yīng)用前景較好，也為重金屬快速檢測提供了新方法和新思路。