房艷 ，于思雨，高俊海 ，宋薇*，宋敬寧

1. 譜尼測試集團(tuán)股份有限公司（北京 100095）；2. 譜尼測試集團(tuán)北京科學(xué)技術(shù)研究院有限公司（北京 100095）

羊乳富含蛋白質(zhì)、脂肪和礦物質(zhì)，被公認(rèn)為營養(yǎng)組成最接近母乳的乳品。因其含有的脂肪球和乳糖的顆粒小，極其適于乳糖不耐受癥人群的飲用。羊乳及羊乳制品受到消費(fèi)者青睞和關(guān)注，國內(nèi)外需求市場不斷升溫。然而，羊乳產(chǎn)量過低，難以滿足日益增長的消費(fèi)需求，在暴利驅(qū)使下時常發(fā)生以牛乳或摻雜牛乳的羊乳冒充純羊乳的惡劣情況。因此，建立一種有效識別純羊乳、牛乳和摻雜牛乳的羊乳的分析方法，對于監(jiān)管規(guī)范市場和保障消費(fèi)者權(quán)益具有重要意義。

研究多以蛋白質(zhì)、脂肪等大分子化學(xué)物質(zhì)的差異來識別牛乳和羊乳，主要利用色譜法、電泳法、免疫化學(xué)法、氣相色譜法等。Chen等[1]以β-乳球蛋白為標(biāo)志物，識別羊乳中是否摻雜牛乳；Mayer等[2]利用高效液相色譜法比較脂肪酸組成以區(qū)分摻入牛乳的羊乳；Hanane等[3]通過氣相色譜法分析甘油三酯組成檢測羊乳中是否摻入牛乳；石燕等[4]采用毛細(xì)管電泳法分離牛乳和羊乳蛋白并以酪蛋白進(jìn)行定性定量。質(zhì)譜、非線性化學(xué)指紋圖譜、電子鼻等新興技術(shù)為牛乳和羊乳的鑒別提供更為多樣且可靠的技術(shù)手段。樊成等[5]基于非線性化學(xué)指紋圖譜法確定牛羊混合二元乳中2種乳的含量比例；魯利利等[6]通過非線性電化學(xué)指紋圖譜的直觀特征和系統(tǒng)相似度模式鑒別不同產(chǎn)地的牛羊乳；馬利杰等[7]利用電子鼻對羊乳粉中摻入牛乳粉進(jìn)行檢測。然而，乳品中含有種類繁多的氨基酸類、糖類、維生素及天然代謝產(chǎn)物等小分子化學(xué)物質(zhì)，且其組成和種類受乳品來源影響較大，但受限于物質(zhì)的含量較少、物質(zhì)復(fù)雜、結(jié)構(gòu)相似等因素，鮮有以小分子化學(xué)物質(zhì)（分子量MW＜500 amu）來識別牛乳和羊乳差異的研究。因超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-QTOF-MS）技術(shù)對于除大分子蛋白質(zhì)外的寬質(zhì)量數(shù)范圍的低揮發(fā)性物質(zhì)具有較高的靈敏度和分辨率，可實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的高效分離以及母離子、碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)測定，且對復(fù)雜基質(zhì)中物質(zhì)的分析鑒定具有一定優(yōu)勢；此外，代謝組學(xué)是一種高通量分析技術(shù)，以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，可對代謝成分進(jìn)行全面、整體和無差別的分析，兩種技術(shù)相結(jié)合可實(shí)現(xiàn)海量有效數(shù)據(jù)的采集、篩選、比對，被廣泛應(yīng)用于乳制品、醫(yī)藥、茶葉、水產(chǎn)品等領(lǐng)域的化學(xué)成分比較分析、主成分鑒定和代謝研究[8-15]。因此，試驗(yàn)利用UPLC-QTOF-MS分析羊乳和牛乳在小分子化學(xué)物質(zhì)層面上的差異，篩選并確定潛在生物標(biāo)志物，并對比甲醇和乙腈作為蛋白沉淀劑的差異，進(jìn)一步建立一種高精確度的牛乳與羊乳的鑒定識別技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 樣品、儀器與試劑

羊乳Ⅰ（G1，源自內(nèi)蒙某牧場）；羊乳Ⅱ（G2，源自內(nèi)蒙某牧場）；羊乳粉Ⅰ（G3，源自內(nèi)蒙某企業(yè)）；羊乳Ⅲ（G4，市售）；羊乳Ⅳ（G5，市售）；羊乳Ⅴ（G6，市售）；羊乳粉Ⅱ（G7，市售）；羊乳粉Ⅲ（G8，市售）；牛乳Ⅰ～Ⅶ（C1～C7，市售）；牛乳粉（C8，市售）；牛乳Ⅷ～Ⅸ（C9～C10，市售）；甲醇（質(zhì)譜級，美國Honeywell Inernational公司）；乙腈（質(zhì)譜級，美國Honeywell Inernational公司）；甲酸（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；亮氨酸腦啡肽（分析純，CAS 58822-25-6，美國Waters公司）；除UPLC-Q-TOF系統(tǒng)用水之外的水皆為超純水，經(jīng)Millipore-Q超純水凈化儀制備；濾膜（尼龍，0.2 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）。

超高效液相-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（Waters Xevo G2-XS QTof/UPLC系統(tǒng)，配有PDA檢測器，美國Waters公司）；Mass Lynx軟件（v 4.1，美國Waters公司）；UNIFI軟件（v 1.9.4，美國Waters公司）；UNIFI 1.8軟件系統(tǒng)（美國Waters公司）；EZinfo軟件（美國Waters公司）；Millipore-Q超純水凈化儀（美國Millipore-Q公司）；Vortex-Genie 2渦旋震蕩器（美國Scientific Industries公司）；H1850臺式高速離心機(jī)（湖南湘義離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)處理

乳粉：稱取1 g（精確至0.01 g）試樣于離心管中，加入4 mL水溶解，渦旋混勻；加入12 mL蛋白沉淀劑，以4 000 r/min離心15 min，取上清液過膜，供測試。乳液：量取4 mL試樣于離心管中，加入12 mL蛋白沉淀劑，以4 000 r/min離心15 min，取上清液過膜，供測試。分別以甲醇和乙腈為蛋白沉淀劑進(jìn)行樣品處理。

1.2.2 儀器條件

1.2.2.1 UPLC條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流動相，0.1%甲酸乙腈（A），0.1%甲酸溶液（B）；梯度洗脫，0～0.5 min，2% A；0.5～6 min，2%～20% A；6～7 min，20%～30% A；7～9 min，30%～70% A；9～10 min 70%～98% A；10～12 min，98%A；12～14 min，98%～2% A；14～16 min，2% A。

1.2.2.2 Q-TOF條件

電噴霧離子源（ESI），正離子和負(fù)離子模式，MSE模式采集；離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣溫度300℃；脫溶劑氣流速600 L/h；錐孔氣流速20 L/h；毛細(xì)管電壓3.0 kV/2.5 kV；錐孔電壓40 V；掃描模式，靈敏度模式；掃描范圍m/z100～1 200；掃描時間0.2 s；碰撞能量，低碰撞能量為off，高碰撞能量10～50 eV；實(shí)時校正液，亮氨酸腦啡肽（正離子條件m/z556.277 1，負(fù)離子條件m/z554.261 5）。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采集羊乳（G組）、牛乳（C組）和混合質(zhì)控（QC）的MSE數(shù)據(jù)，經(jīng)UNIFI軟件完成質(zhì)量校正、加和離子設(shè)定、去噪等處理，導(dǎo)入EZinfo軟件進(jìn)行無監(jiān)督分析的主成分分析（PCA）與有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別式分析（OPLS-DA），在VIP值≥1（化合物對分組的貢獻(xiàn)程度值，VIP）的物質(zhì)中進(jìn)行篩選，并結(jié)合公共平臺資源進(jìn)行潛在生物標(biāo)志物的鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 以甲醇為沉淀劑的代謝組學(xué)分析

2.1.1 TIC和BPI分析

以甲醇為蛋白沉淀劑制備的樣液經(jīng)UPLC-QTOFMS分析，對比羊乳（G7和G8）與牛乳（C9和C10）樣品在正離子模式下的總離子流色譜圖（TIC），無明顯差異，見圖1。

為預(yù)先從譜圖直觀獲得有效信息，將TIC以每一時刻點(diǎn)信號最強(qiáng)的離子碎片（BPI）重繪，如圖2所示。G7、G8和C9、C10這2組樣品的BPI圖存在較明顯差異，在保留時間（RT）2.27，6.56和8.90 min處，C9和C10能觀察到G7和G8中沒有的明顯譜峰。經(jīng)UNIFI分析高碰撞能和低碰撞能譜圖，RT 2.27 min為單電荷低分子量物質(zhì)，RT 6.56 min和8.90 min均為多電荷蛋白或多肽。試驗(yàn)旨在分析羊乳和牛乳在小分子化學(xué)物質(zhì)層面上差異，因此以RT 2.27 min且m/z254.159 7的小分子差異性物質(zhì)為標(biāo)志物進(jìn)一步分析。但EZinfo數(shù)據(jù)處理結(jié)果顯示，該物質(zhì)在牛乳中含量較高，在羊乳中也存在但含量較低，并非最為理想的標(biāo)志物。

2.1.2 多元統(tǒng)計分析

因從譜圖著手的直觀分析非常有限，為了評價2組樣品間差異，進(jìn)一步從數(shù)據(jù)著手進(jìn)行PCA和OPLSDA多元統(tǒng)計分析，見圖3和圖4。每個樣品平行測定3次且穩(wěn)定性良好，過程中以混合質(zhì)控樣品監(jiān)控設(shè)備穩(wěn)定性。如圖3所示，G組樣品全部分布于左側(cè)區(qū)域，C組樣品幾乎全部分布于右側(cè)區(qū)域，說明牛乳和羊乳樣品在此條件下存在顯著差異。PCA分析雖能通過原始數(shù)據(jù)直觀反映兩組樣品間的整體差異，但無法消除隨機(jī)誤差和組內(nèi)誤差，為了更準(zhǔn)確地尋求差異，借由OPLS-DA進(jìn)一步驗(yàn)證。

進(jìn)一步對比分析，得到S-plot圖。VIP值越大，在S-plot圖中的分布越靠近兩極，代表化合物對兩組樣品分組的貢獻(xiàn)程度越大。如圖4所示，明顯觀察到C組對分組貢獻(xiàn)度高的化合物比G組多，與BPI分析的差異性物質(zhì)均來自于C組的結(jié)果相一致。以VIP值≥1為篩選條件，初步得到2 394個物質(zhì)信息，進(jìn)一步以該物質(zhì)只存在于G組或C組中為原則，僅初步篩選出一種RT 1.64 min、m/z137.043 5且只存在于G組的小分子化學(xué)物質(zhì)，且在高碰撞能通道出現(xiàn)m/z119.032 8，m/z110.033 3和m/z135.024 1等碎片信息。

以常見元素C、H、O、N、P、S、Cl、Br為組成元素，推測其化學(xué)式可能為C4H8O5、C5H4N4O、C5H12S2、C3H9N2O2P；借助HMDB和Chemspider等公眾平臺資源，結(jié)合高碰撞能通道子離子信息、光譜信息和物質(zhì)信息等，推測C5H4N4O為該物質(zhì)的可能性最高。該分子式對應(yīng)的化合物包括次黃嘌呤和別嘌醇等，結(jié)合已刊發(fā)的文獻(xiàn)資料，推測該物質(zhì)可能為次黃嘌呤；次黃嘌呤是核苷的代謝產(chǎn)物，是一種重要的生物堿嘌呤，對平喘、舒張支氣管和降壓具有一定作用。曾在羊水、母乳、血液、尿液中[16-24]檢出。

從TIC和BPI未能直觀獲得有效物質(zhì)信息，根據(jù)化合物對分組的貢獻(xiàn)程度值，得到1種只存在于G組羊乳樣品中的小分子化合物，其RT 1.64 min、m/z137.043 5、VIP 1.122 83，可作為一種識別牛乳和羊乳差異的小分子潛在生物標(biāo)志物。該物質(zhì)可能為次黃嘌呤，有待進(jìn)一步確證。

圖2 以甲醇為沉淀劑時G7、G8與C9、C10的BPI圖

圖3 以甲醇為沉淀劑時的PCA圖

圖4 以甲醇為沉淀劑時的OPLS-DA得分圖（S-plot）

2.2 以乙腈為沉淀劑的代謝組學(xué)分析

2.2.1 TIC和BPI分析

由此可見，以甲醇為蛋白沉淀劑時仍有部分多肽或蛋白質(zhì)殘留在樣液中并被檢測到，更換乙腈為蛋白沉淀劑，分析結(jié)果如圖5所示。G1～G8與C1～C8正離子模式下的TIC仍無明顯差異，BPI重繪時G組和C組的組內(nèi)樣品譜圖差異性較小，因此以G1和C6為典型示例進(jìn)行分析，見圖6。

圖5 以乙腈為沉淀劑時G1～G8與C1～C8的TIC圖

圖6 以乙腈為沉淀劑時G1與C6的BPI圖

在保留時間（RT）4.57 min處，G1能觀察到C6中沒有的明顯譜峰，經(jīng)UNIFI分析高碰撞能和低碰撞能譜圖，該物質(zhì)為小分子物質(zhì)且m/z246.169 7，但C組和G組中均存在該物質(zhì)，僅體現(xiàn)為C組含量穩(wěn)定且明顯低于G組，雖非理想的標(biāo)志物，但可以作為特征物質(zhì)輔助鑒定牛乳與羊乳。以常見元素C、H、O、N、P、S、Cl、Br為組成元素，推測其化學(xué)式最可能為C12H23NO4；借助HMDB和Chemspider等公眾平臺資源，結(jié)合高碰撞能通道子離子信息、光譜信息和物質(zhì)信息等，推測C12H23NO4為該物質(zhì)的可能性最高。分子式對應(yīng)的化合物包括2-甲基丁酰卡尼汀、3-甲基丁酰卡尼汀和叔戊?；鈮A等，結(jié)合已刊發(fā)的文獻(xiàn)資料，推測該物質(zhì)可能為2-甲基丁酰卡尼汀，該物質(zhì)在小鼠的血清、人類尿液中可檢出[25-27]。同時，未檢測到多電荷蛋白或多肽差異化合物，說明乙腈對于牛乳和羊乳的沉淀效果較佳。

2.2.2 多元統(tǒng)計分析

如圖7所示，G4、G5、G6與C組處于相同分區(qū)，且該3種羊乳樣品為市售產(chǎn)品，推測可能為加工工藝不同或有牛乳原料引入。其他G組和C組樣品分別分布于左右兩側(cè)，與甲醇為沉淀劑時的結(jié)果一致。排除G4、G5、G6繪制S-plot圖，見圖8。C組對分組貢獻(xiàn)度高的化合物比G組多，與甲醇為沉淀劑時的結(jié)果相同。

圖7 以乙腈為沉淀劑時的PCA圖

圖8 以乙腈為沉淀劑時的OPLS-DA得分圖（S-plot）

以VIP值≥1為篩選條件，初步得到1 597個物質(zhì)信息，以該物質(zhì)只存在于G組或C組為原則，僅初步篩選一種RT 6.65 min、m/z491.285 5且只存在于C組的小分子化學(xué)物質(zhì)，推測其分子式可能為C25H38N4O6、C24H42O10。因分子量較大，可能的化合物達(dá)數(shù)千種且無明顯碎片信息輔助推斷，因此無可疑化合物。但以此標(biāo)志物可有效識別羊乳中的牛乳摻假情況。

同時，與甲醇為沉淀劑的結(jié)果比對，乙腈處理的樣品中也存在m/z254.161 0和m/z137.043 5的物質(zhì)。結(jié)果顯示，m/z254.161 0的物質(zhì)在C組樣品中均檢出，且C2、C3、C4、C5的含量相對較高，G組中則僅新鮮羊乳G1、G2中未檢出，說明該物質(zhì)較為適用于新鮮羊乳的識別；m/z137.043 5的物質(zhì)在C組樣品中均未檢出，G組僅羊乳粉G8未檢出，說明該物質(zhì)較為符合識別牛乳和羊乳的潛在生物標(biāo)志物的要求。乙腈為沉淀劑時確定的m/z491.285 5的物質(zhì)未在以甲醇為沉淀劑時出現(xiàn)。

此外，采用相同方式對負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。雖然在PCA模型中牛乳與羊乳實(shí)現(xiàn)分離，但差異物質(zhì)較少，因此負(fù)離子模式未在此次研究中進(jìn)行詳細(xì)討論。

3 結(jié)論

基于UPLC-QTOF-MS，以小分子化學(xué)物質(zhì)為研究對象，建立一種識別牛乳和羊乳的檢測方法。分別以甲醇、乙腈為蛋白質(zhì)沉淀劑處理試樣，分析正離子模式下的TIC、BPI譜圖，建立主成分分析（PCA）模式，用正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）找出差異代謝產(chǎn)物，以僅存在于牛乳或羊乳為原則，識別出次黃嘌呤和一種m/z491.285 5但未進(jìn)一步鑒定的化合物，另識別出一種在羊乳中含量高，可作為特征物質(zhì)輔助鑒定牛乳與羊乳物質(zhì)，2-甲基丁酰卡尼汀，并借由主成分分析和正交偏最小二乘法-判別式分析等方式，甲醇、乙腈作沉淀劑的結(jié)果相互印證。該方法簡單、便捷，且靈敏度較高，為羊乳和牛乳的識別提供參考，為乳制品市場的進(jìn)一步規(guī)范提供技術(shù)支撐。