李心丹，馬佳宏，王文軍，曾凱芳,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

柑橘類水果在貯藏過程中易被真菌侵染而發(fā)病，造成重大經(jīng)濟損失[1]。其中，由指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的綠霉病是柑橘貯藏期主要的侵染性病害之一[2]。目前，人們多采用抑霉唑、咯菌腈和咪鮮胺等傳統(tǒng)化學殺菌劑來控制綠霉病害。但化學殺菌劑會威脅到環(huán)境和人體健康，并可能使病原菌產(chǎn)生耐藥性，這使其應用受到一定限制[3-4]。近年來，抗菌肽因具有廣譜抑菌性、對宿主細胞低毒性和不易誘導病原菌產(chǎn)生抗性等優(yōu)點，得到越來越多的關注，研究人員期待能將抗菌肽開發(fā)為一種可替代化學殺菌劑的新型藥物或防治方法[5-8]。

Jelleine-I（PFKLSLHL-NH2）是一種從蜜蜂（Apis mellifera）蜂王漿中分離得到的抗菌肽[9]。前期研究表明，Jelleine-I能有效控制柑橘果實綠霉病的發(fā)生，且對血紅細胞幾乎無溶解性[10]。此外，Jelleine-I對細菌和酵母也具有獨特的抑菌活性[11-12]。Jelleine-I的廣譜抑菌性和低溶血性使其具有極大的開發(fā)應用價值。但在抗菌肽的研究過程中，研究者們發(fā)現(xiàn)抗菌肽的抑菌活性容易受到溫度、pH值、陽離子和蛋白酶等的影響[13-15]，這將嚴重阻礙抗菌肽在實際生產(chǎn)中的應用。然而，關于Jelleine-I對P. digitatum的抑菌穩(wěn)定性尚不清晰。為提高現(xiàn)有抗菌肽的抑菌活性，獲得更多能有效抑菌的抗菌肽，研究者們開始致力于改造抗菌肽，如替換多肽序列某些位點的氨基酸、修飾氨基酸、連接天然抑菌物質(zhì)和形成雜合肽等[16-22]。但對于抗菌肽Jelleine-I的改造，僅限于對序列中苯丙氨酸進行鹵化修飾[12]，其他改造方法鮮見報道。

前期研究表明，抗菌肽Jelleine-I能抑制P. digitatum的生長，最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為6.25 μmol/L[10]。本實驗旨在通過研究不同因素對抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響，評價Jelleine-I的抑菌穩(wěn)定性。同時，通過將有抑菌活性的脂肪酸[23-24]、肉桂酸（cinnamic acid，cin）[25]和對羥基肉桂酸（p-hydroxy cinnamic acid，pHCA）[26]與Jelleine-I連接形成脂肽，評價脂肽對柑橘果實綠霉病的控制效果，從而為拓寬抗菌肽Jelleine-I的應用范圍和防治柑橘采后綠霉病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

實驗所用柑橘品種為‘錦橙447’（Citrus sinensic(L.)Osbeckcv.Jingcheng 447#），采摘于重慶市北碚區(qū)果園，采摘后當天運回實驗室。選用大小、顏色、形狀和質(zhì)量均勻、無機械傷的果實作為實驗材料。

指狀青霉分離于自然發(fā)病的豐臍果實，并通過分子生物學方法鑒定，為本實驗室保藏菌種。使用前接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA），25 ℃培養(yǎng)7 d，收集孢子并用無菌水調(diào)至所需濃度。

以抗菌肽Jelleine-I為基礎設計的一系列脂肽（表1），于南京金斯瑞公司使用固相合成方法進行化學合成，純度均大于90%。

表1 實驗所用抗菌肽序列和保留時間Table 1 Sequences and retention time of peptides used in the experiments

蛋白酶K、胰蛋白酶、β-胰凝乳蛋白酶 上海麥克林生化科技有限公司；瓊脂粉 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BXM30R立式高壓滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團安泰有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學儀器有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司；XB-K-25型血細胞計數(shù)板 上海求精生化試劑有限公司；SYNERGYH1MG全自動酶標儀 美國BioTek公司；WH-2漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溫度對抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

實驗參照Thery等[27]的方法并進行了一定的修改。將Jelleine-I干粉用無菌水配制10 MIC的溶液，分別在40、50、60、70、80 ℃下靜置15 min后，快速冷卻至室溫。以常溫下靜置15 min的10 MIC Jelleine-I溶液為對照，將180 μL含有20 倍稀釋馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）的P. digitatum孢子懸浮液（1×104CFU/mL）和20 μL的抗菌肽Jelleine-I溶液（10 MIC）進行混合，使Jelleine-I的終濃度達到MIC?；旌虾罅⒓醇尤?6 孔板中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h后經(jīng)酶標儀測定OD600nm。實驗重復3 次。

1.3.2 pH值對抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

實驗參照Wu Guoqiu等[15]的方法并進行一定的修改。用5 mol/L的HCl或者NaOH溶液將抗菌肽Jelleine-I溶液（10 MIC）的pH值分別調(diào)節(jié)至3、4、5、6、7、8、9、10，室溫靜置1 h后，調(diào)節(jié)pH值至7.0。以不調(diào)節(jié)pH值的Jelleine-I溶液（10 MIC）為對照，按1.3.1節(jié)的方法測定OD600nm。

1.3.3 陽離子對抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

實驗參考López-García[28]和Boziaris[29]等的方法并進行一定修改。配制不同濃度的KCl、NaCl和CaCl2溶液，121 ℃滅菌20 min。將不同濃度的KCl、NaCl和CaCl2溶液與抗菌肽Jelleine-I溶液進行混合，使Jelleine-I終濃度為10 MIC，KCl終濃度分別為5、20、35、50 mmol/L，NaCl終濃度分別為50、100、150、200 mmol/L，CaCl2終濃度分別為1、5、25、125 mmol/L。實驗以不加陽離子的Jelleine-I溶液（10 MIC）為對照，按1.3.1節(jié)的方法測定OD600nm。

1.3.4 蛋白酶對抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

實驗參考Kim[30]和Zhao Yanyan[31]等的方法并進行一定修改。將蛋白酶K、胰蛋白酶和β-胰凝乳蛋白酶用50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）進行溶解，并進行10 倍梯度稀釋。將不同質(zhì)量濃度的蛋白酶溶液與Jelleine-I溶液混合，使Jelleine-I終濃度為10 MIC，蛋白酶的終質(zhì)量濃度分別為1、10-1、10-2、10-3、10-4mg/mL，并在37 ℃條件下反應4 h，以80 ℃滅活處理5 min。實驗以不進行蛋白酶處理的Jelleine-I溶液（10 MIC）為對照，按1.3.1節(jié)的方法測定OD600nm。

1.3.5 抗菌肽Jelleine-I系列脂肽對P. digitatum生長抑制的劑量曲線

實驗參照Jia Fengjing等[11]的方法并進行一定修改。將180 μLP. digitatum孢子懸浮液（1×104CFU/mL，含20 倍稀釋的PDB）和20 μL抗菌肽溶液混合，再立即加入96 孔板中，使抗菌肽的終濃度分別為0、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50 μmol/L和100 μmol/L，然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后用酶標儀測定其OD600nm。以48 h時抗菌肽依舊能完全抑制病原菌生長的最低濃度作為MIC。

1.3.6 抗菌肽Jelleine-I系列脂肽對柑橘果實綠霉病的控制效果

實驗參照Zhou Yahan等[32]的方法并進行一定的修改。果實用體積分數(shù)2%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min，清水沖洗干凈后室溫晾干。果實表面赤道部位用體積分數(shù)75%乙醇溶液擦拭消毒后，用無菌打孔器在果實赤道對稱部位打兩個孔（直徑4 mm、深3 mm）。將新鮮孢子懸浮液與抗菌肽溶液混合后，立即接種10 μL混合液（孢子懸浮液濃度為1×104CFU/mL、抗菌肽濃度為100 μmol/L）于每孔中。實驗以無菌水為陰性對照組，Jelleine-I為陽性對照組，P1、P2、P3、P4、P5和P6為處理組。每組處理15 個果實，重復3 次。待液體完全吸收后，用聚乙烯薄膜袋（170 mm×140 mm）將果實單果包裝，置于25 ℃、相對濕度90%～95%的環(huán)境中貯藏，每天統(tǒng)計發(fā)病率和病斑直徑。當果實傷口區(qū)以外腐爛區(qū)超過1 mm寬時，被認為是發(fā)病的果實。發(fā)病率為腐爛果數(shù)和總果數(shù)的比值，病斑直徑為腐爛區(qū)的測量直徑。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2013軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，運用Graph Pad Prism 5軟件和Adobe Photoshop CS 6軟件制圖；用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，利用Duncan’s多重比較進行差異顯著性檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 溫度對抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

圖1 不同溫度對抗菌肽Jelleine-I抑制P. digitatum的影響Fig. 1 Effect of different temperatures on the antifungal activity of peptide Jelleine-I against P. digitatum

隨著P. digitatu培養(yǎng)時間的延長，孢子開始萌發(fā)，孢子萌發(fā)后的菌絲會懸浮在培養(yǎng)液中，使OD600nm增加。因此，OD600nm與P. digitatum的生長呈正相關，與Jelleine-I的抑菌活性呈負相關。由圖1可知，各處理組的OD600nm與對照組無顯著差異（P＞0.05）。表明抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum的抑菌活性不受溫度（40～80 ℃）的影響，Jelleine-I具有熱穩(wěn)定性。

2.2 pH值對抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

圖2 不同pH值對抗菌肽Jelleine-I抑制P. digitatum的影響Fig. 2 Effect of different pHs on the antifungal activity of peptide Jelleine-I against P. digitatum

如圖2所示，抗菌肽Jelleine-I在不同pH值條件下處理1 h后，其對P. digitatum的生長抑制作用與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。表明抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum的抑菌活性不受pH值的影響，Jelleine-I具有酸堿穩(wěn)定性。

2.3 陽離子對抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

圖3 陽離子K＋（A）、Na＋ （B）和Ca2＋（C）對抗菌肽Jelleine-I抑制P. digitatum的影響Fig. 3 Effects of K+ (A), Na+ (B) and Ca2+ (C) on the antifungal activity of peptide Jelleine-I against P. digitatum

如圖3A所示，在不同濃度的K＋溶液中，抗菌肽Jelleine-I仍能保持對P. digitatum的抑制作用，且抑菌活性與對照無顯著性差異（P＞0.05）。由圖3B可知，Jelleine-I經(jīng)Na＋處理后，僅在高濃度Na＋溶液（200 mmol/L）中，Jelleine-I對P. digitatum的抑菌活性減弱，抑菌活性與對照組存在顯著性差異（P＜0.05）。由圖3C可知，存在Ca2＋的條件下，Jelleine-I的抑菌活性隨著溶液中Ca2＋濃度的增加出現(xiàn)減弱現(xiàn)象。結果表明，不同陽離子會對Jelleine-I的抑菌活性產(chǎn)生不同的影響。

2.4 蛋白酶對抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

圖4 不同蛋白酶對抗菌肽Jelleine-I抑制P. digitatum的影響Fig. 4 Effects of different proteases on the antifungal activity of peptide Jelleine-I against P. digitatum

如圖4所示，經(jīng)3 種低質(zhì)量濃度（10-4mg/mL）蛋白酶處理后，Jelleine-I抑菌活性不發(fā)生改變。但隨著蛋白酶質(zhì)量濃度的增加，Jelleine-I抑菌活性逐漸減弱。其中，當β-胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K的質(zhì)量濃度增加至10-3mg/mL時，Jelleine-I抑菌活性明顯減弱，與對照組比較，OD600nm分別增加了0.086和0.048。當胰蛋白酶質(zhì)量濃度增加至0.01 mg/mL時，OD600nm增加了0.084。

2.5 抗菌肽Jelleine-I系列脂肽對P. digitatum生長抑制的劑量曲線

圖5 抗菌肽Jelleine-I系列脂肽對P. digitatum生長抑制的劑量曲線Fig. 5 Dose-response curves for growth inhibition of P. digitatum by lipopeptides derived from Jelleine-I

如圖5所示，隨著抗菌肽濃度的增加，P. digitatum的生長受到抑制的程度不斷增加。當抗菌肽P2濃度為25 μmol/L，P5濃度為50 μmol/L，P1、P3和P6濃度均為100 μmol/L時，能完全抑制P. digitatum的生長。而抗菌肽P4在實驗濃度范圍內(nèi)沒有出現(xiàn)完全抑菌的效果。因此，實驗所用抗菌肽Jelleine-I、P1、P2、P3、P5和P6的MIC分別為6.25、100、25、100、50、100 μmol/L。

2.6 抗菌肽Jelleine-I系列脂肽對柑橘果實綠霉病的控制效果

如圖6所示，在損傷接種后的3～5 d內(nèi)，Jelleine-I和所有處理組的發(fā)病率都顯著低于陰性對照無菌水處理組（P＜0.05），抗菌肽P1和P2處理組的發(fā)病率和病斑直徑與陽性對照Jelleine-I組之間無顯著性差異（P＞0.05）。在接種后4～5 d內(nèi)，抗菌肽P4、P5和P6處理組病斑直徑整體上顯著高于陽性對照Jelleine-I處理組（P＜0.05），與陰性對照組無顯著性差異（P＞0.05）。在接種后第3天和第4天，抗菌肽P3處理組的發(fā)病率和病斑直徑與Jelleine-I處理組之間無顯著性差異（P＞0.05），在第5天時，抗菌肽P3處理組的發(fā)病率與病斑直徑分別增加至53.33%和37.28 mm，顯著高于陽性對照Jelleine-I處理組（P＜0.05）。

圖6 抗菌肽Jelleine-I系列脂肽對柑橘果實綠霉病發(fā)病率（A）和病斑直徑（B）的影響Fig. 6 Effects of lipopeptides derived from Jelleine-I on disease incidence (A) and lesion diameter (B) of citrus fruit caused by P. digitatum

3 討 論

抗菌肽因具有廣譜抑菌性、低毒性以及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，有望成為一種能替代傳統(tǒng)化學殺菌劑的新型抑菌物質(zhì)。對于任何一種新型抑菌物質(zhì)，厘清其抑菌活性、抑菌穩(wěn)定性和抑菌機理對其后期的開發(fā)應用都具有重要意義。本實驗首先探究了溫度、pH值、陽離子和蛋白酶對Jelleine-I抑菌活性的影響。實驗結果表明，在經(jīng)過不同的溫度和pH值處理后，Jelleine-I均能保持原有抑菌活性，說明Jelleine-I對P. digitatum的抑菌作用具有熱穩(wěn)定性和耐酸堿性。這與大多數(shù)抗菌肽的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性[27,33-34]一致。而Jelleine-I經(jīng)不同陽離子處理后，不同陽離子會對Jelleine-I的抑菌活性產(chǎn)生不同的影響。Jelleine-I經(jīng)一價陽離子（K＋和Na＋）處理后，僅高濃度Na＋（200 mmol/L）能減弱其抑菌活性，在其他的處理中均能保持其原有抑菌活性。而經(jīng)二價陽離子（Ca2＋）處理后，Jelleine-I抑菌活性顯著減弱。經(jīng)研究表明，現(xiàn)有的抗菌肽大部分為陽離子抗菌肽，其主要通過靜電作用與細胞膜結合后發(fā)揮作用[15,35]。然而細胞外陽離子的存在使細胞膜表面的凈電荷增加，從而減弱或者阻止了抗菌肽與細胞膜的靜電作用，最終導致抗菌肽抑菌活性減弱或喪失[36-38]。Jelleine-I經(jīng)不同質(zhì)量濃度的3 種蛋白酶處理后，在低質(zhì)量濃度的3 種蛋白酶中，能保持其原有的抑菌活性，但隨3 種蛋白酶質(zhì)量濃度的增加，Jelleine-I的抑菌活性逐漸減弱。因抗菌肽是由基因編碼、核糖體合成的多肽，所以其抑菌活性可能會受蛋白酶的影響[27,36,39]，在高濃度蛋白酶處理后，Jelleine-I的結構可能被蛋白酶破壞，從而造成其抑菌活性的衰減。

基于前期研究表明，Jelleine-I能控制柑橘果實綠霉病，特異性識別宿主細胞[10]，且其抑菌活性具有熱穩(wěn)定性、耐酸堿性和對低濃度蛋白酶和一價陽離子不敏感等特性，具有潛在的應用價值。為了進一步提高Jelleine-I的抑菌活性，獲得更多能有效控制柑橘果實綠霉病的抗菌肽，本實驗將Jelleine-I與天然抑菌物質(zhì)連接形成脂肽，并研究脂肽對柑橘綠霉病的控制效果。結果表明，6 種脂肽的MIC都高于母肽Jelleine-I，且其抑菌作用均弱于母肽Jelleine-I。損傷接種實驗中，6 種脂肽都能控制綠霉病的發(fā)生，P1和P2的控病效果與Jelleine-I無明顯差異，但其余4 種脂肽的控病能力均弱于Jelleine-I。在對多肽結構與功能研究時發(fā)現(xiàn)，多肽的氨基酸排列順序、長度、兩親性、疏水性、凈電荷和二級結構等參數(shù)均會影響多肽的抑菌活性，其中，疏水性起著非常重要的作用[40-42]。多肽的疏水性可以通過測定多肽在反相高效液相色譜中的保留時間來確定。而在探究疏水性與抑菌活性的關系時發(fā)現(xiàn)，多肽的疏水性應保持在一定范圍，疏水性過高會導致抗菌肽自身聚集，降低抑菌活性；疏水性過低會降低抗菌肽對膜的插入能力，降低抑菌活性[21,43]。由表1可知，實驗中所用脂肽的保留時間都長于Jelleine-I，表明脂肽的疏水性都高于Jelleine-I，這可能也是脂肽抑菌效果弱于母肽的原因。

4 結 論

實驗結果表明，能有效控制柑橘綠霉病的抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum的抑菌活性具有熱穩(wěn)定性、耐酸堿性，對低質(zhì)量濃度蛋白酶和K＋、Na＋不敏感的特點，具有極大的應用價值。將天然抑菌物質(zhì)和Jelleine-I連接后，脂肽P1和P2的控病效果與Jelleine-I無明顯差異，但其余4 種脂肽可能由于疏水性過高，使其控病能力均弱于Jelleine-I。實驗結果可為后期改造抗菌肽以及拓寬抗菌肽Jelleine-I的應用范圍和防治柑橘采后綠霉病提供理論依據(jù)。