鐘 臣

（晉中學(xué)院，山西 晉中 030600）

桑黃（Phellinus igniarius） 又名鮑氏層孔菌，屬多孔菌目 （Polyporales） 多孔菌科 （Polyporaceae）針層孔菌屬（Phellinus），因寄生于桑樹而得名[1]。其子實(shí)體無柄，一般菌蓋呈半球狀，菌肉呈深褐色木質(zhì)。桑黃能夠提高巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞的活性，具有促進(jìn)免疫細(xì)胞活化作用，近年來被廣泛用于生物抗癌、抗腫瘤領(lǐng)域[2]。桑黃還具有活血止血、化飲、止瀉的功效，常被用于治療免疫力低下、減緩人體疲勞[3]。

現(xiàn)代人越來越重視身體健康，經(jīng)常參加各種體育運(yùn)動(dòng)，但在運(yùn)動(dòng)鍛煉后身體會(huì)產(chǎn)生一定的疲勞感，這些都是運(yùn)動(dòng)性疲勞的癥狀，產(chǎn)生根本原因是運(yùn)動(dòng)過量[4]。因此，運(yùn)動(dòng)疲勞的治療一方面要適度鍛煉，合理安排運(yùn)動(dòng)量；另一方面，也要從營(yíng)養(yǎng)和飲食方面補(bǔ)充身體所需的能量，修復(fù)肌肉、神經(jīng)等受損運(yùn)動(dòng)細(xì)胞[5]。通過對(duì)桑黃發(fā)酵液對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞的功效進(jìn)行研究，探討桑黃在抗運(yùn)動(dòng)性疲勞方面的作用，為我國(guó)桑黃資源的利用和桑黃天然藥物、保健品提供理論依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 材料和試劑

選用桑黃由河北省微生物研究所提供；馬鈴薯、玉米粉、麩皮、淀粉、酵母等均購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；葡萄糖、維生素B1、維生素B2購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站中心化工廠（化學(xué)純）；蒸餾水、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂等購(gòu)自淄博宏潔化工有限公司（化學(xué)純）。

1.2 試驗(yàn)儀器

YJ超凈工作臺(tái)，蘇州市蘇凈集團(tuán)安泰公司；BJPX-H88Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱，濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司；DT-1000型電子天平，常熟市金羊天平儀器廠；PB-10型pH計(jì)，上海亞榮儀器有限公司；CS101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，中國(guó)重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司；FW-400A型粉碎機(jī)，北京科偉儀器有限公司；HH-80數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市億能試驗(yàn)儀器廠；RE-30/50L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海況勝實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；HF240-300全自動(dòng)生化分析儀，山東濟(jì)寧正豐醫(yī)療科技有限公司；BCD-180TMPS冰箱，海爾集團(tuán)。

2 桑黃發(fā)酵液制備及粗多糖的提取

2.1 桑黃發(fā)酵液制備

桑黃發(fā)酵液培養(yǎng)周期短、菌絲多糖得率高，因此采用桑黃菌絲體發(fā)酵來制備桑黃[6]。桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯20.00%、葡萄糖3.00%、酵母膏 0.30%、磷酸二氫鉀 0.30%、七水硫酸鎂0.15%，維生素 B120 μg·100-1mL-1、維生素 B230 μg·100-1mL-1。接種好的桑黃菌靜置24 h后上搖床，在（28±1）℃、轉(zhuǎn)速180 r·min-1條件下進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)3 d～7 d，每天觀察菌絲生長(zhǎng)情況，選擇合適時(shí)間進(jìn)行轉(zhuǎn)接試驗(yàn)，在接種量15%、培養(yǎng)溫度27℃、搖瓶轉(zhuǎn)速160 r·min-1條件下再培養(yǎng)5 d～7 d。

每天觀察搖瓶中發(fā)酵液及菌絲球，發(fā)酵完成后的培養(yǎng)液見圖1。

如圖1所示，當(dāng)菌絲球顏色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闇\褐色，菌絲球變?yōu)楸砻婀饣穆研涡∏?，原先附著在菌絲球表面的菌刺已消失，而脫落的菌絲大多都已發(fā)生自溶，肉眼很難再觀察到時(shí)發(fā)酵液培養(yǎng)完成，此時(shí)獲得的桑黃液體發(fā)酵菌絲產(chǎn)量最大。將菌絲球過篩洗滌后在烘箱60℃下烘干30 min，即得干燥桑黃菌絲體，成品為黃棕色、質(zhì)脆的片狀物。

2.2 桑黃粗多糖的提取

桑黃粗多糖的提取方法很多，水提法、復(fù)合酶法、稀堿提取法、鹽提取法、醇提法、超聲波提取法等。而目前對(duì)桑黃等真菌菌絲多糖的提取方法多采用幾種方法的聯(lián)合應(yīng)用。根據(jù)研究?jī)?nèi)容選取水提醇沉法作為桑黃菌絲多糖的提取方法。主要步驟為：桑黃菌絲體經(jīng)干燥、粉碎、醇析、殘?jiān)娓?、熱水提取后，再將提取液濃縮、醇沉即可得桑黃粗多糖，具體操作如下。

將桑黃菌絲體粉碎成粉末，過80目篩后按1∶20的料液比加80%的乙醇，80℃回流提取2 h后去除雜質(zhì)和小分子糖等。經(jīng)醇析后趁熱抽濾，取濾渣放入烘箱60℃下烘干30 min。按料液比為1∶50于95℃水浴鍋中水浴回流提取2 h。提取液抽濾后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行蒸發(fā)濃縮。最后在桑黃的多糖濃縮液中加入5倍體積無水乙醇，在4℃冰箱中靜置沉淀24 h。將沉淀后的濃縮液上離心機(jī)3 000 r·min-1離心10 min，取上清液回收乙醇，粗多糖沉淀用丙酮洗滌脫色，再用無水乙醇洗滌脫水，最后用乙醚洗滌脫去乙醇，重復(fù)以上洗滌步驟3次。最終得桑黃粗多糖。

3 抗運(yùn)動(dòng)疲勞試驗(yàn)

3.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用健康昆明種二級(jí)雄性小白鼠，體重為（20±5） g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始試驗(yàn)。

40只小鼠稱重后分成4組進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，每組10只。高劑量組每日定時(shí)經(jīng)口給小鼠灌胃1次劑量為300 mg·kg-1體重的桑黃多糖；中劑量組每日定時(shí)經(jīng)口給小鼠灌胃1次劑量為200 mg·kg-1體重的桑黃多糖；低劑量組每日定時(shí)經(jīng)口給小鼠灌胃1次劑量為100 mg·kg-1體重的桑黃多糖；空白對(duì)照組灌胃同樣體積純凈水。

每日上午進(jìn)行小鼠游泳訓(xùn)練10 min～20 min，下午進(jìn)行小鼠灌胃試驗(yàn)，連續(xù)訓(xùn)練灌胃30 d。

3.2 抗疲勞負(fù)重游泳試驗(yàn)

最后一次灌胃1 h后，分組進(jìn)行負(fù)重游泳試驗(yàn)，在小鼠尾部1/3處系2 g左右的鉛皮，將小鼠放置于深約30 cm的水箱中迫使其不停游泳，水溫控制在25℃左右，記錄小鼠從入水至全部身體沉入水中7 s后的時(shí)間，作為小鼠負(fù)重游泳時(shí)間。

3.3 全血乳酸、乳酸脫氫酶和血尿素氮測(cè)定

小鼠抗疲勞負(fù)重游泳試驗(yàn)后，每組取5只小鼠取眼球血，室溫下靜置30 min（不加抗凝劑），上離心機(jī)3 500 r·min-1離心15 min吸取分離血清，將分離好的血清轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，放入4℃冰箱中避光儲(chǔ)存，24 h內(nèi)使用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行小鼠血液全血乳酸、乳酸脫氫酶和血尿素氮測(cè)定。

3.4 肌糖元及肝糖元測(cè)定

小鼠抗疲勞負(fù)重游泳試驗(yàn)后，每組取5只小鼠，采用斷頸法處死小鼠，立即解剖并切取小鼠肌肉和肝臟，制備成糖元檢測(cè)液，采用分光光度法測(cè)定肌肉中的肌糖元含量及和肝臟中肝糖元的含量。

4 試驗(yàn)結(jié)果與分析

4.1 小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果

4組小鼠的負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 小鼠負(fù)重游泳時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Test results of weight-bearing swimming time of mice

由表1可知，灌胃不同劑量桑黃多糖的3個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間都有增加，其中高劑量組對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響最大，與對(duì)照組相比提升了40.28%；小鼠平均負(fù)重游泳時(shí)間為111.87 min，與對(duì)照組相比提升了26.16%。

4.2 全血乳酸、肌酸激酶和血尿素氮測(cè)定結(jié)果

小鼠血液指標(biāo)結(jié)果見表2。

表2 小鼠血液指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Test results of blood indexes of mice

由表2可知，高劑量、中劑量、低劑量組小鼠全血乳酸含量與對(duì)照組相比均有所下降，其中高劑量組下降明顯，與對(duì)照組相比下降了12.51%；低劑量組與中劑量組全血乳酸值差別不大。高劑量組小鼠肌酸激酶含量與對(duì)照組相比下降了15.91%，中劑量、低劑量組肌酸激酶含量與對(duì)照組相比略微上升。高劑量組小鼠血尿素氮含量與對(duì)照組相比下降了15.28%；中劑量、低劑量組小鼠血尿素氮含量與對(duì)照組相比差別不大。

4.3 肌糖元及肝糖元測(cè)定

小鼠肌糖元及肝糖元測(cè)定結(jié)果見表4。

表3 小鼠肝糖原、肌糖原檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Test results of glycogen in liver and muscle of mice

由表4可知，高劑量、中劑量、低劑量組小鼠的肝糖原和肌糖原含量較對(duì)照組均有一定幅度的提高。其中高劑量、中劑量、低劑量組小鼠的肝糖原提升幅度分別為10.13%、32.90%和55.37%；高劑量、中劑量、低劑量組小鼠的肌糖原提升幅度分別為6.76%、10.81%和29.73%。

5 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，桑黃發(fā)酵液中的多糖生物活性能延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、有效降低血乳酸的含量、降低血液中肌酸激酶的含量、補(bǔ)充細(xì)胞流失的蛋白質(zhì)、修復(fù)受損肌肉細(xì)胞、抑制低血糖。

綜上所述，桑黃發(fā)酵液中的多糖能夠提高小鼠的抗氧化和抗疲勞能力，對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞有明顯的減緩作用。