韓志俊

（遵義醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，貴州 遵義563000）

虎奶菇（Pleurotus tuber-regium） 又稱核耳菇、茯苓側(cè)耳等，是一種木腐真菌[1]。虎奶菇核有極強的抗病能力，而且藥效保持時間很長，可以長年保存不腐、不變質(zhì)[2]。虎奶菇的子實體和菌核均可食用或藥用，特別是子實體中含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，是不可多得的美食[3]；虎奶菇還具有滋補強壯、解毒收斂的藥用功效，對咳嗽、哮喘有神奇的療效，而其藥用功效的主要物質(zhì)是虎奶菇多糖[4]。多糖又稱多聚糖（polysaccharide），主要分為植物多糖和動物多糖兩大類，研究表明多數(shù)食用菌均含有一定量的多糖[5]?；⒛坦蕉嗵强梢詮钠渥訉嶓w或菌絲體發(fā)酵提取，也可以從其菌核中提取。其中，通過虎奶菇的子實體分離提取出的多糖因其組成成份多、化學結(jié)構(gòu)復雜而受到廣泛的關(guān)注?；⒛坦蕉嗵蔷哂姓{(diào)節(jié)免疫力、抗氧化、對高血糖和高血脂的抑制作用，而且在抵抗癌細胞和腫瘤方面的有很好的療效，還有很多未知功效亟待發(fā)現(xiàn)[6]。通過對虎奶菇子實體多糖的提取工藝開展研究，并對其藥理作用進行分析，以期為開發(fā)更多的虎奶菇多糖藥物及保健產(chǎn)品提供參考。

1 虎奶菇子實體多糖的提取工藝研究

1.1 提取工藝簡介

目前，虎奶菇子實體多糖主要是從虎奶菇干品或新鮮虎奶菇產(chǎn)品中提取分離得到，常用的提取方法有水提法、酶提法、酸提法、堿提法和超聲波、微波等輔助提取方法[7]，通過比較幾種虎奶菇子實體多糖的提取方法來確定最佳的提取工藝參數(shù)和條件，為虎奶菇資源的綜合開發(fā)利用和虎奶菇多糖保健品和藥品的加工提供理論依據(jù)。

1.2 試驗材料

1.2.1 藥品與試劑

無水乙醇，西安三浦化學試劑有限公司；纖維素酶（100 000 U·g-1），中山市鴻盛生物科技有限公司；果膠酶（100 000 U·g-1），夏盛（北京）生物科技開發(fā)有限公司；氫氧化鈉、鹽酸，西安斯坦利生物科技有限公司。

1.2.2 儀器與設(shè)備

DK-98-1電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；SHZ-III型循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；BS323S電子分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司；PB-1 pH計，德國Sartorius公司；DHG-9003電熱鼓風干燥箱，上海滬南科學儀器廠；SL3-120B超聲波清洗機，上海舍巖儀器有限公司。

1.3 試驗方法設(shè)計

1.3.1 虎奶菇子實體多糖的提取工藝

虎奶菇子實體經(jīng)清洗、晾干、切片，在60℃下烘箱中干燥60 min后，上粉碎機制成粉末狀，過80目篩后得虎奶菇子實體粉末備用。

1）水浸提虎奶菇子實體多糖

準確稱取虎奶菇粉末2.0 g置于200 mL錐形瓶中，加入適量的蒸餾水，置于一定溫度條件下的水浴鍋中保溫浸提一段時間，真空抽濾或離心得到濾液，將濾液真空濃縮至原體積的1/4后，加入4倍體積的無水乙醇，靜置24 h后過濾或離心分離得到沉淀，將沉淀置于60℃條件下干燥即得虎奶菇子實體粗多糖。

2）超聲波輔助提取虎奶菇子實體多糖

準確稱取虎奶菇粉末2.0 g置于200 mL錐形瓶中，加入適量的蒸餾水，置于一定溫度、一定功率條件下的超聲波清洗機中處理一段時間，真空抽濾或離心得到濾液，將濾液真空濃縮至原體積的1/4后，加入4倍體積的無水乙醇，靜置24 h后過濾或離心分離得到沉淀，將沉淀置于60℃條件下干燥即得虎奶菇子實體粗多糖。

3） 酶提法結(jié)合超聲波輔助提取虎奶菇子實體多糖

準確稱取虎奶菇粉末2.0 g置于200 mL錐形瓶中，分別加入一定量的酶及適量的蒸餾水，置于一定溫度、一定功率條件下的超聲波清洗機中處理一段時間，于100℃條件下保溫5 min滅酶，然后真空抽濾或離心得到濾液，將濾液真空濃縮至原體積的1/4后，加入4倍體積的無水乙醇，靜置12 h后過濾或離心分離得到沉淀，將沉淀置于60℃條件下干燥即得虎奶菇子實體粗多糖。

1.3.2 虎奶菇子實體多糖得率的計算

采用重量分析法來確定虎奶菇子實體多糖得率（E，%），計算公式為：

式中：W1為虎奶菇子實體多糖的質(zhì)量（g）；W2為虎奶菇子實體粉末的質(zhì)量（g）。

2 試驗結(jié)果與分析

首先進行單因素試驗，探討固液比、浸提時間和溫度等單一因素對熱水浸提對虎奶菇子實體多糖提取效果的影響，其次再進行熱水浸提的工藝參數(shù)優(yōu)化。

2.1 熱水浸提虎奶菇子實體多糖的單因素試驗

2.1.1 固液比對虎奶菇子實體多糖提取效果的影響

準確稱取虎奶菇子實體粉末2.0 g置于200 mL錐形瓶中，按固液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50分別加入蒸餾水10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL，置于溫度為60℃條件下的水浴鍋中保溫浸提4 h，真空抽濾或離心得到濾液，將濾液真空濃縮至原體積的1/4后，加入4倍體積的無水乙醇，靜置24 h后過濾或離心分離得到沉淀，將沉淀置于60℃條件下干燥得到虎奶菇子實體粗多糖，稱重后計算虎奶菇子實體多糖得率。

試驗結(jié)果表明，在固液比為（1∶10）～（1∶30）時，隨固液比的增加多糖得率呈線性增加；但在（1∶30）～（1∶50） 時，虎奶菇子實體多糖得率先是緩慢增加后再下降。分析其原因可能是因為隨著固液比的增大，溶劑中多糖總量有所增加；當固液比達1∶30時，多糖得率達到最大，此時細胞內(nèi)外的濃度基本平衡；繼續(xù)增大固液比對多糖的得率影響很小，且溶劑用量過大會增加后續(xù)的濃縮時間，能耗增大。因此，綜合考慮選擇固液比為1∶30比較合適。

2.1.2 浸提時間對虎奶菇子實體多糖提取效果的影響

準確稱取虎奶菇子實體粉末2.0 g置于200 mL錐形瓶中，按固液比1∶30加入蒸餾水30 mL，置于60℃的水浴鍋中保溫浸提1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，真空抽濾或離心得到濾液，將濾液真空濃縮至原體積的1/4后，加入4倍體積的無水乙醇，靜置24 h后過濾或離心分離得到沉淀，將沉淀置于60℃條件下干燥得到虎奶菇子實體粗多糖，稱重后計算虎奶菇子實體多糖得率。

試驗結(jié)果表明，浸提時間為1 h～3 h時，隨時間延長虎奶菇子實體多糖得率逐漸增加；在3 h～5 h時，得率上升變得緩慢。這可能是因為時間過短溶質(zhì)與溶劑的接觸不充分，多糖得率低，隨時間延長而多糖不斷溶出進入到溶劑中，多糖得率隨之增大。因此，綜合考慮選擇浸提時間為3 h比較合適。

2.1.3 溫度對虎奶菇子實體多糖提取效果的影響

準確稱取虎奶菇子實體粉末2.0 g置于200 mL錐形瓶中，按固液比1∶30加入蒸餾水30 mL，置于溫度為20℃、40℃、60℃、80℃、100℃條件下的水浴鍋中保溫浸提3 h，真空抽濾或離心得到濾液，將濾液真空濃縮至原體積的1/4后，加入4倍體積的無水乙醇，靜置24 h后過濾或離心分離得到沉淀，將沉淀置于60℃條件下干燥得到虎奶菇子實體粗多糖，稱重后計算虎奶菇子實體多糖得率。

試驗結(jié)果表明，當浸提溫度為20℃～80℃時，虎奶菇子實體多糖得率隨溫度的升高逐漸增加，浸提溫度為80℃～100℃時，多糖得率的增加變得緩慢。這是因為溫度升高使得分子的熱運動加快，有利于分子的溶出；但溫度超過90℃時，可能會對多糖的生物活性產(chǎn)生影響，同時會造成更多的能源消耗。因此，綜合考慮可選擇浸提溫度為80℃比較合適。

2.2 熱水浸提虎奶菇子實體多糖工藝的優(yōu)化

通過單因素試驗確定了幾個重要的參數(shù)范圍，在此基礎(chǔ)上再根據(jù)響應(yīng)面原理[5]設(shè)計試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 熱水浸提試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of hot water extraction test

如表1所示，通過組合設(shè)計對熱水浸提法提取虎奶菇子實體多糖的固液比、浸提時間和浸提溫度進行優(yōu)化試驗。

2.3 超聲波輔助提取對虎奶菇子實體多糖工藝的優(yōu)化

根據(jù)上述試驗步驟，首先進行單因素試驗，確定固液比為1∶30，超聲處理時間為30 min，超聲處理溫度為65℃，超聲處理功率為200 W。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，再進行超聲波輔助提取工藝的優(yōu)化，依據(jù)響應(yīng)曲面設(shè)計的原理，對超聲波輔助提取虎奶菇子實體多糖的固液比、超聲時間、超聲溫度和超聲功率4個單一因素進行優(yōu)化，最終得到超聲波輔助提取多糖的最佳工藝條件為：固液比1∶30，溫度68℃，功率190 W，此條件下虎奶菇子實體多糖得率為9.87%。

2.4 酶提法結(jié)合超聲波輔助提取虎奶菇子實體多糖工藝的優(yōu)化

采用上述試驗方法，首先進行單因素試驗，選擇纖維素酶作為提取用酶種類，固液比為1∶30，加酶量為0.5%，酶解pH 5；結(jié)合超聲波輔助單一因素中，綜合考慮酶解時間等因素，超聲溫度為50℃、超聲時間為30 min、超聲功率為200 W時比較合適。

其次，在酶提法結(jié)合超聲波輔助提取虎奶菇子實體多糖工藝的優(yōu)化上，對固液比、加酶量（纖維素酶）、超聲時間和超聲功率各因素進行優(yōu)化試驗，最終得到酶法結(jié)合超聲波輔助提取食用菌多糖的最佳工藝條件為：固液比1∶30，加酶量0.6%，超聲時間30 min，超聲功率200 W，此條件下虎奶菇多糖得率為13.05%。