杜繼明 王貴鑫 趙雪峰 宮愛民

（大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院肛腸外科，遼寧 大連 116021）

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域，傳統(tǒng)的原發(fā)性結(jié)腸癌及其轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌模型的制作遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了飛速發(fā)展的腫瘤手術(shù)縮小化理念需求，因此建立精準(zhǔn)顯微鏡輔助下手術(shù)模型的制作迫在眉睫。近年來臨床研究結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)早期結(jié)直腸癌選擇了以腫瘤為中心的局部切除手術(shù)和（或）附加前哨淋巴結(jié)清掃，與結(jié)腸癌根治性手術(shù)相比，其5年生存率無顯著差異[1-2]。本研究首選建立穩(wěn)定的結(jié)腸癌模型后，此基礎(chǔ)上再建立結(jié)腸癌切除手術(shù)模型，并與開關(guān)手術(shù)模型相比較術(shù)中、術(shù)后情況及生存率情況。由于理論上可行的結(jié)腸癌根治手術(shù)模型的制作障礙，加上人力、物力及技術(shù)上的制約，只好選用了結(jié)腸區(qū)段切除手術(shù)模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料：7周齡雄性，體質(zhì)量18～20 g，BALb/c品系20只實(shí)驗(yàn)裸鼠購于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29由大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心構(gòu)建并提供。本研究由經(jīng)大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞混懸液制備：將人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29在37 ℃、5%CO2，含10%小牛血清的培養(yǎng)基內(nèi)傳代培養(yǎng)，每2～3 d洗換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)細(xì)胞融合達(dá)80%～90%，采用胰酶消化后，1200 rpm/min離心3 min，棄上清液，將無小牛血清的培養(yǎng)基加細(xì)胞洗滌3次，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，用無小牛血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至4×107/mL，共備1 mL。將已制備的細(xì)胞混懸液在冰浴中保存，備30 min內(nèi)完成接種。

1.2.2 模型設(shè)計(jì)：制模前1周為實(shí)驗(yàn)裸鼠安定期，需對(duì)實(shí)驗(yàn)裸鼠禁止進(jìn)行一切刺激性操作。參與模型的實(shí)驗(yàn)裸鼠共20只，首先建立穩(wěn)定的裸鼠原發(fā)性結(jié)腸癌模型4周，其后將結(jié)腸癌模型裸鼠隨機(jī)分成10只顯微鏡輔助下結(jié)腸區(qū)段切除術(shù)組（結(jié)腸癌切除手術(shù)模型組-研究組）和10只對(duì)照組（開關(guān)手術(shù)模型組）。建立結(jié)腸癌模型后實(shí)驗(yàn)裸鼠總觀察周期為8周。

1.2.3 建立顯微鏡輔助下裸鼠結(jié)腸癌模型：選用地氟醚進(jìn)行裸鼠全身麻醉。制模全程采用SMZ-B2/T2體視顯微鏡完成操作。首先，取下腹正中10 mm小切口進(jìn)入腹腔，利用無損傷鑷子尋找盲腸，并選定距盲腸根部30 mm“升結(jié)腸”作為制模部位。其次，采用31號(hào)注射器傾斜30°角進(jìn)針約0.5 mm，將人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29混懸液50μL（細(xì)胞數(shù)為2×106）經(jīng)“升結(jié)腸”黏膜層和肌肉層之間緩慢注入。待確認(rèn)注射部位腸壁顏色變白、腫脹及無滲漏，采用止血紗布外加濕紗布覆蓋注射部位1 min。最后，掀開濕紗布見脾臟無滲漏后逐層關(guān)腹。

1.2.4 建立顯微鏡輔助下裸鼠結(jié)腸區(qū)段切除術(shù)模型（結(jié)腸癌切除手術(shù)模型）：麻醉及開腹顯露同上述。首先，采用鈦夾或絲線結(jié)扎標(biāo)記待切除的兩側(cè)腸管，切除范圍為距腫瘤兩側(cè)緣1 cm。其次，選用裸鼠專用腸鉗或血管鉗鉗夾兩側(cè)待吻合的腸管，切除腫瘤為中心的腸管后，采用10-0血管縫合線連續(xù)縫合。最后，見縫合處血運(yùn)良好，并縫合牢固后止血紗布環(huán)周附于吻合口周圍，且進(jìn)行逐層關(guān)腹。

1.2.5 建立顯微鏡下裸鼠結(jié)腸癌開關(guān)手術(shù)模型：麻醉及開腹顯露同上述。不進(jìn)行對(duì)結(jié)直腸癌模型的任何創(chuàng)傷性操作。

1.2.6 解剖裸鼠和觀察指標(biāo)：每天常觀察、記錄實(shí)驗(yàn)裸鼠的一般狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)裸鼠觀察期滿予以處死。處死后立即解剖觀察，并具體記錄腹腔內(nèi)血性腹水、腸梗阻、淋巴結(jié)腫大/轉(zhuǎn)移及腹膜種植情況。完整移除病變標(biāo)本后，利用4%多聚甲醛充分固定。所有病變標(biāo)本以最大直徑為中心切開并制作組織蠟塊，并以4 μm厚度切片后進(jìn)行H&E染色，顯微鏡下明確病變標(biāo)本的性質(zhì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。研究組和對(duì)照組的計(jì)量比較采用χ2-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，研究組和對(duì)照組的生存分析采用Kaplan-Meler進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組制模情況比較：結(jié)腸癌模型成瘤率100%（20/20）。結(jié)腸癌切除手術(shù)模型組和開腹手術(shù)模型組在術(shù)中無1例死亡。結(jié)腸癌模型成瘤率100%（20/20）。結(jié)腸癌切除手術(shù)模型組術(shù)中無1例死亡。結(jié)腸癌切除手術(shù)模型組血性腹水、腸梗阻、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹膜種植轉(zhuǎn)移明顯少于開關(guān)手術(shù)模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組制模情況比較[n（%）]

2.2 兩組生存情況比較：研究組組頻臨死亡處死1例，而觀察期滿8周處死9例；而對(duì)照組頻臨死亡處死7例，而觀察期滿8周處死3例。兩組生存曲線分析，結(jié)腸癌切除手術(shù)模型組生存率明顯優(yōu)于開關(guān)手術(shù)模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組生存曲線

3 討 論

對(duì)于建立穩(wěn)定的裸鼠結(jié)腸癌模型是研究人結(jié)腸癌精準(zhǔn)治療的首要緩解。裸鼠結(jié)腸癌模型制作包括自發(fā)性腫瘤模型、誘發(fā)性腫瘤模型、移植性結(jié)腸癌模型及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腫瘤模型，無論選擇任何方法都有它的長處和適應(yīng)范圍[3]。由于區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者局部轉(zhuǎn)移的第一步，因此裸鼠結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型對(duì)抗腫瘤藥物的篩查和腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究具有重要意義[4]。近期對(duì)裸鼠結(jié)腸癌淋巴管生成模型的制作研究也逐漸升溫[5]。為了更進(jìn)一步深入研究結(jié)直腸癌患者的轉(zhuǎn)移機(jī)制和抗轉(zhuǎn)移治療方法，需求與人更接近或非細(xì)胞系的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型的制作[6]。為此，今后的動(dòng)物模型制作方向應(yīng)符合模擬人類疾病進(jìn)展。裸鼠結(jié)腸癌模型的評(píng)價(jià)手段多種多樣，譬如剖腹探查、MRI技術(shù)、IVIS技術(shù)及小動(dòng)物專用PET/CT技術(shù)[7-9]。除剖腹探查外，其他的動(dòng)物模型評(píng)價(jià)手段還仍未得到普及。

結(jié)直腸癌患者的治療原則是以手術(shù)治療為主的綜合治療，但人結(jié)腸癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立的研究只停步在單純建立裸鼠結(jié)腸癌模型的初步階段[10]。由于實(shí)驗(yàn)用鼠科動(dòng)物的腸管壁薄、糞便塊似腸管粗大、肉眼或放大鏡難以完成精準(zhǔn)的吻合技術(shù)而腸切除相關(guān)的報(bào)道寥寥無幾，更談不上切除腫瘤周圍水腫的腸切除術(shù)。顯微鏡輔助下腫瘤區(qū)段切除術(shù)的優(yōu)勢(shì)和技巧在于：①選擇全身麻醉；②選用術(shù)野直觀的體視顯微鏡；③顯微鏡的放大倍數(shù)高達(dá)4～40倍；④選用裸鼠專用腸鉗或血管鉗鉗夾腸管；⑤選用10-0血管縫合線連續(xù)縫合法進(jìn)行腸-腸吻合。不僅針對(duì)早期結(jié)腸癌行腫瘤為中心的局部切除加前哨淋巴結(jié)清掃，且針對(duì)早期直腸癌行TEM手術(shù)等技術(shù)理念的更新是本研究設(shè)計(jì)的初衷[1-2,11]。為提高顯微鏡下腸管吻合技術(shù)，建議顯微鏡或放大鏡下連續(xù)縫合完成剪斷膠皮手套的手指吻合后，灌滿自來水觀察有無滲漏。顯微鏡操作技術(shù)的可行性和腫瘤學(xué)行為的安全性方面，本研究結(jié)果證實(shí)：結(jié)腸癌模型成瘤率100%，同時(shí)結(jié)腸癌切除手術(shù)模型組和術(shù)中無1例死亡；結(jié)腸癌切除手術(shù)模型組血性腹水、腸梗阻、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹膜種植轉(zhuǎn)移明顯少于開關(guān)手術(shù)模型組，而且結(jié)腸癌切除手術(shù)模型組生存率明顯優(yōu)于開關(guān)手術(shù)模型組。

綜上所述，結(jié)腸癌切除手術(shù)模型為操作技術(shù)要求較高的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。結(jié)腸癌切除手術(shù)模型在技術(shù)層面上安全、可行，但在相對(duì)局部晚期結(jié)腸癌模型中的遠(yuǎn)期腫瘤學(xué)行為有待于進(jìn)一步探索。