于寶丹 鄭潤(rùn)輝 李海明

（1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510000；2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510000）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種骨髓性造血芽細(xì)胞異常增殖的血液惡性腫瘤[1]。目前，AML的治療方法主要有化學(xué)治療（化療）、放射治療、靶向治療、免疫治療、干細(xì)胞移植等。臨床上根據(jù)患者的不同情況選擇不同的綜合治療方案，但仍然以化療為主。AML細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥成為AML治療過(guò)程中的主要障礙。研究AML細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制以及如何克服AML細(xì)胞的耐藥表型，對(duì)提高AML化療效果具有重要的實(shí)際意義。

高遷移率族蛋白2（high mobility group AT-hook 2，HMGA2）是高遷移率族蛋白家族成員之一。HMGA2在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，并參與腫瘤耐藥的發(fā)生[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，干擾HMGA2能增加野生型AML細(xì)胞對(duì)柔紅霉素（daunorubicin，DNR）的敏感性[5]。但是對(duì)于HMGA2能否逆轉(zhuǎn)AML細(xì)胞對(duì)柔紅霉素的耐藥性仍未闡明。本文將以HL-60柔紅霉素耐藥細(xì)胞株HL-60/DNR為研究對(duì)象，分析干擾HMGA2能否逆轉(zhuǎn)HL-60/DNR對(duì)柔紅霉素的耐藥性，評(píng)估HMGA2作為克服白血病細(xì)胞耐藥的分子靶點(diǎn)的潛能。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：柔紅霉素產(chǎn)自美國(guó)Merck；AML細(xì)胞系HL-60產(chǎn)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胎牛血清均產(chǎn)自美國(guó)Gibco公司；培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶產(chǎn)自美國(guó)Corning；Lipofectamine RNAiMAX產(chǎn)自美國(guó)Invitrogen；CCK8試劑盒產(chǎn)自日本Dojindo Molecular Technologies公司；Trizol和SYBR GREEN qPCR Super Mix來(lái)自美國(guó)Invitrogen公司；引物和siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；β-半乳糖苷酶（β-GAL）活性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC2580）產(chǎn)自北京索萊寶科技有限公司；HMGA2一抗產(chǎn)自美國(guó)Abcam公司；ImProm-IITM Reverse Transcription System產(chǎn)自美國(guó)promega；CXF96型熒光定量PCR儀產(chǎn)自美國(guó)Bio-Rad；MultiscanMK3型全自動(dòng)酶標(biāo)儀產(chǎn)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：按照上海中科院細(xì)胞庫(kù)提供的方法培養(yǎng)，即在37 ℃、5% CO2的條件下用添加了20%胎牛血清的Iscove's Modified Dulbecco's Medium基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)HL-60細(xì)胞。HL-60柔紅霉素耐藥細(xì)胞株HL-60/DNR為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞對(duì)DNR產(chǎn)生耐藥性。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與siRNA轉(zhuǎn)染：設(shè)計(jì)合成HMGA2的siRNA（si-HMGA2，GGAAAGUGUCUUCAAACAAUU）和陰性對(duì)照siRNA（si-NC，UUCUCCGAACGUGUCACGUTT）。將HL-60/DNR細(xì)胞分為正常培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染si-NC組和轉(zhuǎn)染si-HMGA2組。按照Lipofectamine RNAiMAX的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3 熒光定量PCR：轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，Trizol法提取總RNA；按照ImProm-IITM Reverse Transcription System的說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；按照SYBR GREEN qPCR Super Mix的說(shuō)明配制PCR反應(yīng)體系，CXF96型熒光定量PCR儀上完成熒光定量PCR反應(yīng)。采用2-△△CT法[6]計(jì)算HMGA2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。內(nèi)參基因β-actin和HMGA2的引物序列如下：HMGA2上游引物，ACCTAGGAAATGGCCACAACA；HMGA2下游引物，TATAAGATTGCCCGGGTGGT；β-actin上游引物，AGCGAGCATCCCCCAAAGTT；β-actin下游引物，GGGCACGAAGGCTCATCATT。

1.2.4 Western blot：轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后，將定量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并通過(guò)半干法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。漂洗后，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，HMGA2或者GAPDH一抗稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜。次日，經(jīng)過(guò)TBST洗膜后，加入相應(yīng)二抗稀釋液37 ℃孵育1 h。漂洗后，在暗室中曝光。

1.2.5 CCK8實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞接種在96孔板，如2.2.2準(zhǔn)備正常培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染si-NC組和轉(zhuǎn)染si-HMGA2組HL-60細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，使用0、0.1、1、5、7.5和10 μg/mL的DNR處理各組細(xì)胞。分別于DNR處理0和24 h后，加入CC8試劑，按照CCK8試劑盒的說(shuō)明檢測(cè)450 nm處的吸光值（OD450）。按照如下公式計(jì)算抑制率：抑制率=1-（ODDNR-ODBlank）/（OD0μg/mL-ODBlank）。使用GraphPad Prism 7軟件計(jì)算各組細(xì)胞的DNR半抑制濃度（IC50）。

1.2.6 β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)：如2.2.2準(zhǔn)備正常培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染si-NC組和轉(zhuǎn)染si-HMGA2組HL-60細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，按照β-半乳糖苷酶（β-GAL）活性檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示。多因素方差分析檢驗(yàn)細(xì)胞增殖活性的差異，單因素方差分析三組之間實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGA2在HL-60/DNR細(xì)胞中高表達(dá)：如圖1所示，與野生型HL-60相比，HL-60柔紅霉素耐藥細(xì)胞株HL-60/DNR中HMGA2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯提高（P＜0.05）。

2.2 成功沉默HL-60/DNR細(xì)胞中HMGA2基因表達(dá)：如圖2所示，cell組和si-NC組HL-60/DNR細(xì)胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。與si-NC組相比，si-HMGA2組HL-60/DNR細(xì)胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表達(dá)水顯著下降（P＜0.05），說(shuō)明轉(zhuǎn)染si-HMGA2可成功沉默HL-60/DNR細(xì)胞中HMGA2基因表達(dá)。

2.3 沉默HMGA2基因表達(dá)增強(qiáng)DNR對(duì)HL-60/DNR細(xì)胞的敏感性：使用不同濃度的DNR處理cell組、si-NC組和si-HMGA2組HL-60/DNR細(xì)胞，并采用CCK8方法檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光值，并計(jì)算抑制率。如圖3所示，DNR對(duì)cell組和si-NC組HL-60/DNR細(xì)胞的抑制率無(wú)明顯差異。與si-NC組相比，DNR對(duì)si-HMGA2組HL-60/DNR細(xì)胞的抑制率顯著提高（P＜0.05）。另外，DNR對(duì)cell組、si-NC組和si-HMGA2組HL-60/DNR細(xì)胞的IC50分別為4.46 μg/mL、4.67 μg/mL和0.98 μg/mL，說(shuō)明。這些結(jié)果說(shuō)明沉默HMGA2基因表達(dá)能增強(qiáng)DNR對(duì)HL-60/DNR細(xì)胞的敏感性。

圖1 HL-60和HL-60/DNR細(xì)胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

圖2 cell組、si-NC組和si-HMGA2組HL-60/DNR細(xì)胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

圖3 DNR對(duì)cell組、si-NC組和si-HMGA2組HL-60/DNR細(xì)胞的抑制率。

2.4 沉默HMGA2基因表達(dá)增強(qiáng)HL-60/DNR細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性：如圖4所示，cell組和si-NC組的β-半乳糖苷酶活性無(wú)明顯差異；與si-NC組相比，si-HMGA2組HL-60/DNR細(xì)胞的β-半乳糖苷酶活性顯著提高（P＜0.05）。

圖4 cell組、si-NC組和si-HMGA2組HL-60/DNR細(xì)胞的β-半乳糖苷酶活性。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，HMGA2不僅參與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，也參與腫瘤耐藥的發(fā)生。目前認(rèn)為HMGA2主要通過(guò)抑制DNA損傷導(dǎo)致的凋亡和增加腫瘤干細(xì)胞的自我更新誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性[7-8]。近年來(lái)有研究表明腫瘤細(xì)胞衰老障礙直接影響化療效果，也是影響腫瘤多藥耐藥的一個(gè)重要因素[9]。細(xì)胞衰老是指細(xì)胞在外在微環(huán)境變化或內(nèi)在特定基因表達(dá)與失活等因素作用下不可逆地脫離細(xì)胞周期并不可逆地喪失增殖能力后進(jìn)入的一種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性淋巴瘤的治療中，無(wú)論凋亡途徑是否正常，采用誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的方法均可以提高化療效果[10]。Rebbaa研究小組將表達(dá)組織蛋白酶L的干擾載體導(dǎo)入淋巴瘤細(xì)胞系（HL-60）中，發(fā)現(xiàn)該干擾載體可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生衰老，逆轉(zhuǎn)對(duì)阿霉素的耐藥性[11]。那么，在AML發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，HMGA2在AML細(xì)胞衰老障礙及逆轉(zhuǎn)化療耐藥中是否發(fā)揮作用吶？本文將著重探討這些問(wèn)題，拓展HMGA2參與腫瘤耐藥的分子機(jī)制，評(píng)估HMGA2作為逆轉(zhuǎn)AML細(xì)胞多藥耐藥分子靶點(diǎn)的可能性，為提高AML的臨床化療效果提供新的研究方向和理論基礎(chǔ)。

我們研究發(fā)現(xiàn)，與野生型細(xì)胞相比，HMGA2在HL-60/DNR細(xì)胞中高表達(dá)。結(jié)果提示HMGA2可能參與AML多藥耐藥性的產(chǎn)生。鑒于HMGA2的表達(dá)特征及在其他腫瘤細(xì)胞耐藥性中的作用，我們推測(cè)干擾HMGA2基因的表達(dá)可能會(huì)逆轉(zhuǎn)HL-60/DNR細(xì)胞的耐藥性。為了驗(yàn)證該推論，我們?cè)O(shè)計(jì)了HMGA2的siRNA序列并轉(zhuǎn)染到HL-60/DNR細(xì)胞中以干擾HMGA2基因的表達(dá)。結(jié)果表明，沉默HMGA2基因的表達(dá)可以明顯降低HL-60/DNR細(xì)胞的IC50，說(shuō)明沉默HMGA2基因的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)HL-60/DNR細(xì)胞的耐藥性。這些結(jié)果提示，HMGA2具有作為AML治療靶點(diǎn)尤其是輔助化療靶點(diǎn)的潛能。有研究表明，HMGA2增強(qiáng)了5-氟尿嘧啶對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥性[12]。另外，高表達(dá)的HMGA2是預(yù)測(cè)AML不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)[13]，且干擾HMGA2能增加野生型AML細(xì)胞對(duì)DNR的敏感性[5]。這些研究報(bào)道可進(jìn)一步支持我們本文的結(jié)論。

另外，我們分析了干擾HMGA2表達(dá)對(duì)HL-60/DNR細(xì)胞衰老的影響。我們發(fā)現(xiàn)沉默HMGA2基因表達(dá)能增強(qiáng)HL-60/DNR細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性。β-半乳糖苷酶活性判定細(xì)胞衰老水平的重要指標(biāo)[14]。當(dāng)細(xì)胞衰老時(shí)，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性水平出現(xiàn)上調(diào)[14]。因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默HMGA2基因表達(dá)能加速HL-60/DNR細(xì)胞的衰老進(jìn)程。鑒于細(xì)胞衰老能進(jìn)程能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性，我們推測(cè)沉默HMGA2通過(guò)加速HL-60/DNR細(xì)胞的衰老進(jìn)程逆轉(zhuǎn)對(duì)DNR的耐藥性。

總之，我們發(fā)現(xiàn)HMGA2在耐藥細(xì)胞HL-60/DNR中高表達(dá)，沉默HMGA2可以逆轉(zhuǎn)HL-60/DNR的DNR耐藥性并加速細(xì)胞的衰老。