陳福東，肖 帥，張鴻雁，畢林濤

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.手術(shù)室；2.核醫(yī)學(xué)科；3.腫瘤血液科，吉林 長春130033)

據(jù)統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國腎癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，至2008年已躍居我國男性惡性腫瘤發(fā)病率第10位[1]。腎癌的傳統(tǒng)治療方法效果并不理想。有文獻(xiàn)表明[2]，基于腎細(xì)胞癌的分子水平的治療策略顯示出潛在的優(yōu)勢(shì)。近來的研究表明，自噬在抗腫瘤藥物引起的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用[3]。本研究利用體外培養(yǎng)人腎癌ACHN細(xì)胞，探討自噬在硼替佐米誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎癌ACHN細(xì)胞系購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；G250考馬斯亮藍(lán)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基胺基甲烷(Tris-Base)與四甲基二乙胺(TEMED)購于美國Sigma公司；HEPES緩沖液、L-谷氨酰胺購于美國Amresco公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)購于江蘇晶美生物科技有限公司；Caspase-3、LC3購于Santa Cruz公司；胰蛋白酶、辣根過氧化物酶羊抗鼠二抗購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)購于北京賽馳生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1藥物、試劑配置 配置1640完全培養(yǎng)液、D-Hanks液、PBS液、0.25%胰蛋白酶溶液、電泳緩沖液、電泳轉(zhuǎn)移緩沖液、12%分離膠、濃縮膠。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) a)細(xì)胞復(fù)蘇;b)細(xì)胞培養(yǎng)及傳代;c)細(xì)胞凍存。

1.2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖率 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，波長490 nm檢測(cè)，增殖率=(1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組)×100%。

1.2.4Western blotting 檢測(cè)硼替佐米對(duì)人腎癌ACHN細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3及自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)水平的影響

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各個(gè)樣本均數(shù)間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，采用方差分析比較不同組間的均數(shù)差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 硼替佐米對(duì)ACHN細(xì)胞增殖抑制率影響

分別應(yīng)用0 nM、5 nM、10 nM、20 nM、30 nM、50 nM硼替佐米處理ACHN細(xì)胞24 h后，MTT檢測(cè)結(jié)果(圖 1)表明，硼替佐米呈劑量依賴性地抑制細(xì)胞增殖。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用20 nM濃度進(jìn)行單獨(dú)以及聯(lián)合用藥。

圖1 硼替佐米對(duì)ACHN細(xì)胞24 小時(shí)抑制率

2.2 硼替佐米對(duì)ACHN細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達(dá)水平的影響

分別應(yīng)用10 nM、20 nM、30 nM 硼替佐米處理ACHN細(xì)胞24h，Western Blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達(dá)水平(圖2 )。與對(duì)照組相比，硼替佐米可以明顯地增加ACHN細(xì)胞凋亡。

圖2 硼替佐米對(duì)caspase-3蛋白的影響

2.3 硼替佐米對(duì)ACHN細(xì)胞自噬相關(guān)蛋LC3表達(dá)水平的影響

分別應(yīng)用10 nM、20 nM、30 nM 硼替佐米處理ACHN細(xì)胞24 h，Western Blotting檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)水平(圖 3)，硼替佐米明顯增加了ACHN細(xì)胞的自噬。

圖3 硼替佐米對(duì)ACHN細(xì)胞LC3蛋白的影響

2.4 自噬抑制劑3-MA聯(lián)合硼替佐米對(duì)ACHN細(xì)胞增殖及對(duì)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase 3 的表達(dá)水平的影響

聯(lián)用3-MA可以進(jìn)一步抑制ACHN細(xì)胞增殖(圖4)，促進(jìn)ACHN細(xì)胞凋亡(圖5)。

3 討論

硼替佐米為硼酸肽類化合物,它可選擇性作用到26S蛋白酶體,通過可逆性地抑制蛋白酶體活性而抑制多種蛋白的降解過程,從而影響多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞周期,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性。大多數(shù)的抗癌藥都能引起其敏感細(xì)胞發(fā)生凋亡，而凋亡過程的發(fā)生需要Caspases的參與。Caspases家族是細(xì)胞凋亡過程中的效應(yīng)蛋白，通過蛋白酶水解，活化的Caspases可以進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。而本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的Caspase-3則是這個(gè)家族中最重要的死亡執(zhí)行者，它廣泛分布在各類細(xì)胞中，主要以無活性的酶原形式存在，而活化的Caspase-3則能夠促進(jìn)凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在本實(shí)驗(yàn)中，硼替佐米明顯增強(qiáng)了Caspase-3在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)，促進(jìn)腎癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

自噬是細(xì)胞通過各種途徑在自噬溶酶體內(nèi)進(jìn)行自我消化，分解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等?；A(chǔ)水平的自噬幫助細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)，實(shí)現(xiàn)自我更新等。當(dāng)受到較嚴(yán)重?fù)p傷無法自我修復(fù)，細(xì)胞就會(huì)發(fā)生自噬性死亡[5]。細(xì)胞自噬過程分四個(gè)階段：啟動(dòng)、延長、成熟和降解。自噬相關(guān)蛋白Beclin1在啟動(dòng)階段發(fā)揮重要作用，LC3主要在延長階段發(fā)揮作用。在自噬過程中，定位于細(xì)胞質(zhì)中的P62與經(jīng)泛素化的蛋白結(jié)合，P62蛋白再與LC3-II形成復(fù)合物，在溶酶體內(nèi)被降解，以至于P62蛋白在細(xì)胞自噬過程中不斷被消耗[6,7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，硼替佐米促進(jìn)腎癌細(xì)胞的自噬，明顯降低了P62的表達(dá)水平。

圖4 3-MA聯(lián)合硼替佐米對(duì)ACHN細(xì)胞增殖影響

圖5 3-MA聯(lián)合硼替佐米對(duì)ACHN細(xì)胞凋亡的影響

據(jù)報(bào)道，許多抗癌劑誘導(dǎo)自噬[8-10]，導(dǎo)致自噬細(xì)胞死亡可能是這些藥物殺死腫瘤細(xì)胞的重要機(jī)制；然而，最新文獻(xiàn)顯示雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬可以保護(hù)各種腫瘤細(xì)胞系對(duì)一般凋亡刺激誘導(dǎo)的凋亡。自噬是否真的是一個(gè)重要的細(xì)胞死亡機(jī)制仍有高度爭議，因?yàn)樗灿锌赡苁羌?xì)胞試圖生存的機(jī)制。對(duì)于自噬與凋亡的交互作用，可以分三類即合作關(guān)系、對(duì)抗關(guān)系與推動(dòng)關(guān)系[11]。合作關(guān)系即自噬和凋亡協(xié)同作用，或通過互補(bǔ)機(jī)制共同導(dǎo)致細(xì)胞死亡；對(duì)抗關(guān)系即自噬與凋亡在引起細(xì)胞的過程中起著截然相反的作用，自噬不但不引起細(xì)胞死亡，反而在凋亡過程中維持癌癥細(xì)胞存活；推動(dòng)關(guān)系中自噬雖然也是程序性細(xì)胞死亡，但并沒有直接參與細(xì)胞死亡，而是為細(xì)胞凋亡提供營養(yǎng)支持。例如細(xì)胞遭受營養(yǎng)剝奪時(shí)，自噬水平的上調(diào)可以維持胞內(nèi)ATP水平，使得內(nèi)磷脂酰絲氨酸得以向胞外暴露釋放出凋亡信號(hào)，如果自噬受到抑制，這類ATP依賴性特征性凋亡發(fā)生也會(huì)減少，但對(duì)其它凋亡反應(yīng)并無影響[12]。本研究結(jié)果表明抑制自噬可以增強(qiáng)硼替佐米誘導(dǎo)的ACHN細(xì)胞凋亡作用，這提示自噬可能在ACHN細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮促進(jìn)其存活的作用，抑制自噬增強(qiáng)了硼替佐米抗腫瘤作用。