鄧啟華，牟忠林，汪奕龍，馮勇軍，王明婧，林麗英，李澤濛，盧大松

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科,海南 ?？?70311)

鼻息肉(Nasal polyps)是來源于鼻粘膜和鼻旁竇的息肉樣組織[1]。經(jīng)常伴有變應(yīng)性鼻炎[2]。鼻息肉的臨床癥狀包括鼻充血、慢性鼻竇炎、嗅覺喪失和頭痛[1]。鼻息肉發(fā)病機制尚不清楚，最普遍認為是由鼻過敏引起的[2]。在變態(tài)反應(yīng)發(fā)作期間，肥大細胞被激活釋放化學(xué)介質(zhì)，例如組胺，以誘導(dǎo)粘膜水腫和局部炎癥，在鼻息肉的發(fā)展中起重要作用。鼻息肉的發(fā)病機制中，IgE起到了不可或缺的作用[3]，其不僅增加了變態(tài)反應(yīng)的癥狀，引起機體Th1/2細胞分化的不均衡，還能合成各種細胞毒性物質(zhì)，促進嗜酸性粒細胞的生成，引起肥大細胞脫顆粒。傳統(tǒng)免疫學(xué)認為鼻息肉的發(fā)生機制只是由單純的I型變態(tài)反應(yīng)通路調(diào)控[4]，但在最新的微觀免疫學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)了新的影響因子microRNA。microRNA(miRNA)已顯示在調(diào)節(jié)細胞活性中起關(guān)鍵作用。miRNA是一類進化保守的、內(nèi)源性的、非編碼的小RNA，其長度約為22個核苷酸。據(jù)估計，它們可調(diào)節(jié)60%以上的蛋白質(zhì)編碼基因，這些基因與靶基因的3'UTR結(jié)合，從而抑制靶基因的翻譯和/或誘導(dǎo)靶基因mRNA的降解[5]。目前已經(jīng)證明一部分miRNA在變態(tài)反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用[6]。目前國內(nèi)外尚無文獻闡述變態(tài)反應(yīng)性疾病中鼻息肉中IgE的表達與miRNA-223的表達之間的影響，本實驗擬建立采用革蘭陰性細菌產(chǎn)物脂多糖(LPS)建立的亞洲人特點鼻息肉小鼠模型，檢測鼻息肉小鼠鼻黏膜組織miRNA-223的表達。然后構(gòu)建慢病毒敲低載體感染小鼠后區(qū)鼻腔黏膜組織，檢測慢病毒敲除鼻息肉小鼠鼻黏膜組織中的IgE與miR-223表達，闡明鼻息肉中IgE的表達與miR-223的表達之間的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 30例鼻息肉患者的鼻息肉樣本(男15例，女15例),年齡17-51歲，平均(32.1+9.2)歲。30例同期行單純鼻中隔矯正手術(shù)患者的鼻甲樣本(男15例，女15例)，年齡18-55歲，平均(34.1+8.1)歲。兩組患者在性別、年齡間無統(tǒng)計學(xué)差異意義(P>0.05)，具有可比性。在研究之前的三個月中，沒有患者接受糖皮質(zhì)激素或其他抗體治療。所有患者均簽署了知情同意書，所有實驗均獲得本醫(yī)院倫理委員會的批準與監(jiān)督。所有組織標本都保存在-80℃直至使用。

1.1.2動物 80只體重18-22 g雄性健康C57BL/6J小鼠購自北京生命科學(xué)研究所。小鼠置于溫度為22±2℃，濕度為60±5%，光照/黑暗周期為12 h的環(huán)境下飼養(yǎng)。小鼠可以自由獲取食物和飲用水。

1.1.3試劑 脂多糖(LPS)購自北京索萊寶科技有限公司。TRIzol試劑、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB GreenTM Premix Ex Taq II試劑盒購自TaKaRa公司。陰性對照、miR-223 inhibitor由Genepharma公司合成?？剐∈竺庖咔虻鞍譋(IgE)多克隆抗體、抗小鼠中性粒細胞過氧化物酶(MPO)多克隆抗體、抗小鼠嗅覺標記蛋白(OMP)多克隆抗體和山羊抗鼠IgG二抗購自美國Abcam公司。ELISA試劑盒購于美國BOSTER公司。HE試劑盒和免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋。PVDF膜購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1臨床組織樣本 收集鼻息肉病患者和健康對照者的下鼻甲的黏膜。提取總RNA用于相應(yīng)的基因表達。

1.2.2鼻息肉小鼠模型制作及分組給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，分為4組，每組20只，分別為：(1)對照組(control組)、(2)模型組(LPS組)、(3)模型+陰性對照組(miR-NC組)、(4)模型+miR-223 inhibitor組(miR-223 inhibitor組)。造模組小鼠每側(cè)鼻孔每次滴入10 μl LPS(10 μg/μL)，一周3次，持續(xù)12周；對照組小鼠每側(cè)鼻孔每次滴入10 μl無菌生理鹽水，一周3次，持續(xù)12周。造模期間剔除死亡和沒有造模成功的小鼠。第13周，第3組小鼠通過尾靜脈注射轉(zhuǎn)染空載病毒的293T細胞懸液(5×106個/mL)200 μl；第4組小鼠通過尾靜脈注射轉(zhuǎn)染敲低miR-223慢病毒的293T細胞懸液(5×106個/mL)200 μl；第1組和第2組小鼠尾靜脈注射等體積的無菌生理鹽水。

1.2.3嗅覺障礙評估 食物小球隨機埋藏在墊料中，深度1 cm左右。實驗前1天晚上8點開始，各組小鼠禁糧，但水可以自由飲用。第2天上午將各組小鼠投入到實驗場中，300秒內(nèi)(取3次測試平均值)未找到食物小球的小鼠定為嗅覺功能存在障礙。

1.2.4HE染色 實驗結(jié)束后立即將小鼠鼻腔外側(cè)壁先用4%多聚甲醛固定，然后放在4% EDTA中脫鈣處理，待其完全軟化后即可包埋、切片(5 μm)，用蘇木精和曙紅(HE)染色，通過顯微鏡觀察每個組織切片的圖像，并使用顯微鏡以200倍的放大倍數(shù)拍攝鼻粘膜組織組織的圖像。

1.2.5免疫組織化學(xué) 實驗結(jié)束后立即將小鼠鼻腔外側(cè)壁先用4%多聚甲醛固定，然后放在4% EDTA中脫鈣處理，待其完全軟化后即可包埋、切片(5 μm)、脫水、緩沖液清洗，3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加非免疫動物血清20 min，滴加一抗、PBS沖洗、滴加二抗、沖洗后加ABC復(fù)合物、DAB顯色，并使用顯微鏡以200倍的放大倍數(shù)拍攝圖像。

1.2.6ELISA檢測鼻腔中細胞因子的表達 小鼠通過腹腔注射10%水合氯醛深麻醉并進行部分氣管切開術(shù)。從氣管的開口沿鼻孔的方向?qū)?2號導(dǎo)管插入后鼻孔。將無菌生理鹽水(1 ml)輕輕注入鼻腔，灌洗液從前鼻孔收集，在220×g和4℃下離心10 min，并將上清液保存在-20℃下。鼻灌洗后在麻醉下通過脫臼處死小鼠。通過ELISA檢測上清液中的細胞因子表達水平。

1.2.7qPCR 實驗結(jié)束后，用剪刀將小鼠鼻部整個剪下來，然后從中間剪開，暴露整個鼻腔外側(cè)壁，這時可用小剪刀或剝離子將鼻腔外側(cè)壁粘膜剝除干凈。用TRIzol試劑提取鼻粘膜組織總RNA。用Nanodrop 2000儀器測量樣品總RNA濃度，并將每個配對的樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。然后按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用TB GreenTM Premix Ex Taq II試劑盒進行qPCR。U6和β-actin分別用作miRNA和mRNA的內(nèi)部參考。使用FTC-3000p實時PCR系統(tǒng)完成實驗后，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。其中使用的引物見表1。

PrimerSequence(5'-3')miR-223Forward:5'-GGTGGTGAATACCCTCCTG-3'Reverse:5'-GTCTGTCCGTGGTGCTGA-3'IgEForward:5'-GGCTGGCAACATAACAGAGAA-3'Reverse:5'-CCCCACATCTATACACACCTCC -3'U6Forward:5'-AAGACGGGCGGAGAGAAACC-3'Reverse:5'-CGTTGACTCCGACCTTCACC-3'β-actinForward:5'-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3'Reverse:5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3'

1.2.8Western blot 各組小鼠鼻粘膜組織用RIPA裂解提取總蛋白，并通過BCA方法進行定量，樣品經(jīng)變性后進行上樣。按照實驗步驟進行電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉(5%脫脂奶粉)-一抗孵育(4℃過夜)-二抗孵育(室溫1 h)-顯影曝光。Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-223和IgE在鼻息肉患者中高表達

qPCR檢測鼻息肉患者組織中miR-223和IgE的表達水平。結(jié)果表明，與健康對照者相比，鼻息肉患者的鼻黏膜組織中miR-223的表達水平明顯增加(P<0.01)(圖1A)。同時，我們還觀察到鼻息肉患者中IgE的表達與健康對照組相比有所增加(P<0.01)(圖1B)。

圖1 miR-223和IgE在鼻息肉患者(Nasal polyps)(n=30)和健康對照者(Healthy controls)(n=30)的鼻粘膜組織中的表達

(A)qPCR檢測鼻息肉患者組和健康對照組織中miR-223的相對表達水平。(B)qPCR檢測鼻息肉患者組和健康對照組織中IgE的相對表達水平。**P<0.01與健康對照組比較

2.2 各組小鼠鼻粘膜組織中miR-223和IgE的表達水平

qPCR檢測各組小鼠鼻粘膜組織中miR-223和IgE的表達水平。結(jié)果表明，與control組比較，LPS組和miR-NC組小鼠鼻粘膜組織中miR-223和IgE的表達水平均上調(diào)(P<0.05)，miR-223 inhibitor組與control組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；miR-223 inhibitor組小鼠鼻黏膜組織中miR-223的表達水平較LPS組和miR-NC組顯著下調(diào)(均P<0.001)(圖2A)；同時，我們還觀察到miR-223 inhibitor組小鼠粘膜組織中IgE的表達與LPS組和miR-NC組相比顯著下降(均P<0.001)。 (圖2B)。

2.3 各組小鼠嗅覺功能評估

食物埋藏實驗檢測各組小鼠的嗅覺水平。結(jié)果表明，與control組比較，LPS組、miR-NC和miR-223 inhibitor組小鼠找到食物小球的時間均顯著增加(P<0.001)；miR-223 inhibitor組小鼠找到食物小球的時間較LPS組和miR-NC組減少(均P<0.05)(圖3)。

圖2 miR-223和IgE在各組小鼠鼻粘膜組織中的表達

圖3 食物埋藏實驗檢測各組小鼠嗅覺水平

2.4 各組小鼠鼻粘膜組織病理變化

HE染色檢測各組小鼠鼻粘膜組織的病理變化。結(jié)果表明，與control組比價，LPS組、miR-NC和miR-223 inhibitor組小鼠均出現(xiàn)息肉樣病變，鼻腔粘膜息肉數(shù)量均顯著增加(P<0.001)；miR-223 inhiitor 組小鼠鼻腔粘膜息肉和上皮破壞數(shù)量較LPS組和miR-NC組明顯減少(均P<0.01)(圖4)。

2.5 各組小鼠鼻粘膜組織中MPO和OMP的表達情況

免疫組織化學(xué)檢測各組小鼠鼻腔和鼻竇中的炎性細胞和嗅覺上皮的變化。結(jié)果表明，與control組比較，LPS組、miR-NC和miR-223 inhibitor組小鼠鼻腔和鼻竇中MPO+細胞數(shù)量均明顯增多(P<0.01)，OMP+細胞數(shù)量均明顯減少(P<0.05)；miR-223 inhibitor組較LPS組和miR-NC組相比，小鼠鼻腔和鼻竇中MPO+細胞數(shù)量減少(均P<0.05)，OMP+細胞數(shù)量明顯增加(均P<0.01)(圖5)。

圖4 HE染色檢測各組小鼠鼻粘膜組織的變化

圖5 免疫組織化學(xué)檢測各組小鼠鼻粘膜組織中MPO和OMP的表達水平

2.6 各組小鼠鼻腔灌洗液中細胞因子的表達水平

ELISA檢測各組小鼠鼻腔中細胞因子的表達。結(jié)果表明，與control組比較，LPS組、miR-NC和miR-223 inhibitor組小鼠鼻腔灌洗液中IgE、TNF-α、IL-6的表達水平均升高(P<0.05)；miR-223 inhibitor組小鼠鼻腔灌洗液中IgE、TNF-α、IL-6的表達水平較LPS組和miR-NC組均降低(P<0.05)。

圖6 ELISA檢測各組小鼠鼻腔灌洗液中細胞因子的表達情況

2.7 各組小鼠鼻粘膜組織中IgE蛋白表達情況

Western blot檢測各組小鼠鼻粘膜組織中IgE的表達情況。結(jié)果表明，與control組比較，LPS組、miR-NC和miR-223 inhibitor組小鼠鼻粘膜組織中IgE蛋白的表達水平均上調(diào)(P<0.05)；miR-223 inhibitor組小鼠鼻粘膜中IgE蛋白的表達水平較LPS組和miR-NC明顯下調(diào)(均P<0.01)。

3 討論

鼻息肉(Nasal polyps)是上呼吸道的一種常見疾病，常見的癥狀為鼻塞、嗅覺喪失、頭痛和面部疼痛等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[7]。根據(jù)受影響的炎癥細胞的不同，鼻息肉分為兩種類型：一種類型主要由嗜酸性粒細胞為主，另一種類型主要由嗜中性粒細胞為主。每種類型都具有不同的免疫組織病理學(xué)特征[8]。鼻息肉的病理機制尚不完全清楚，涉及多種因素，例如病毒、細菌、真菌和過敏原等。盡管使用鼻內(nèi)皮質(zhì)類固醇激素和功能性內(nèi)窺鏡鼻竇手術(shù)可顯著提高鼻息肉的治愈率，但約有10%的患者在手術(shù)后仍經(jīng)歷復(fù)發(fā)性鼻息肉[9]。因此，鼻息肉的病理機制需要進一步闡明。

圖7 Western blot檢測各組小鼠鼻粘膜組織中IgE蛋白表達情況

IgE在鼻息肉的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，“IgE介導(dǎo)的過敏”發(fā)炎反應(yīng)引起紅腫、癢、疼痛，甚至是鼻炎等各種過敏癥狀。最近的一些研究報告表明，IgE在鼻息肉中的定量水平增加，發(fā)生嚴重的嗜酸性炎癥[4]。但是，IgE介導(dǎo)的鼻息肉促炎反應(yīng)的調(diào)控機制仍有待充分研究。

microRNA(miRNA)是一類短的非編碼RNA，通過靶向miRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)來誘導(dǎo)信使RNA(mRNA)降解或翻譯抑制，從而對基因表達進行負調(diào)控[10]。目前，已經(jīng)有1000多種miRNA在RNA數(shù)據(jù)庫中鑒定并報告了這些RNA，其中許多被用作診斷，預(yù)后和治療的分子生物標記物[11,12]。微小RNA參與不同的細胞功能，包括分化，生長，增殖和凋亡[12]。miRNA廣泛參與免疫反應(yīng)，例如免疫細胞的成熟和分化、自然免疫反應(yīng)等。研究表明，miR-223在變態(tài)反應(yīng)疾病中的研究中目前處于熱門，有研究通過使用蛋白芯片檢測鼻息肉模型小鼠中不同的類型miRNA的表達差異，最終發(fā)現(xiàn)miR-223在各種鼻息肉模型中均有不同程度的高表達。因此，miR-223可能是治療鼻息肉的潛在靶點。

本實驗中，我們先進行了qPCR法檢測了miR-223和IgE在鼻息肉患者和鼻息肉小鼠鼻粘膜組織中miR-223和IgE的差異表達，結(jié)果表明，miR-223和IgE在鼻息肉患者和鼻息肉小鼠鼻粘膜組織中表達顯著上調(diào)，miR-223 inhibitor能抑制miR-223和IgE的表達。食物埋藏實驗中，我們發(fā)現(xiàn)LPS組小鼠找到食物小球的時間較control組顯著增加，出現(xiàn)明顯的嗅覺障礙；與LPS組相比，miR-223 inhibitor組小鼠找到食物小球的時間較LPS組小鼠減少；HE染色結(jié)果表明，LPS組小鼠明顯觀察到息肉樣病變且?guī)в邢⑷鈽硬∽兊恼衬ぴ龊瘢琺iR-223 inhiitor 組小鼠鼻腔粘膜息肉和上皮破壞數(shù)量減少；提示鼻息肉小鼠造模成功，敲低miR-223可抑制鼻息肉的發(fā)展。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果表明，LPS組小鼠鼻腔和鼻竇中MPO+細胞數(shù)量顯著增多，OMP+細胞數(shù)量顯著減少；miR-223 inhibitor組較LPS組相比，小鼠鼻腔和鼻竇中MPO+細胞數(shù)量減少，OMP+細胞數(shù)量明顯增加，提示敲低miR-223可能抑制炎癥的發(fā)展，改善鼻息肉小鼠的嗅覺功能。ELISA檢測結(jié)果表明，LPS組小鼠鼻灌洗液中的IgE、TNF-α、IL-6表達水平顯著上調(diào)，與LPS組相比，miR-223 inhibitor組小鼠鼻腔中IgE、TNF-α、IL-6的表達水平降低，提示敲低miR-223可能抑制細胞因子的表達。Western blot結(jié)果表明，敲低miR-223可下調(diào)IgE蛋白的表達，提示miR-223可能調(diào)控IgE的表達。

綜上所述，miR-223在鼻息肉的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，敲低miR-223可能下調(diào)IgE的表達、抑制鼻息肉的生成及減輕炎性反應(yīng)。因此，miR-223可能通過調(diào)控IgE的表達來影響鼻息肉形成相關(guān)細胞因子的釋放從而調(diào)控鼻息肉的發(fā)展，但具體的機制應(yīng)進一步研究。