李詩(shī)卉 鄧靜 粟倩 梁詩(shī)瑤 伊美瑾 林麗美 孫維廣

〔摘要〕 目的 表征夏枯草果實(shí)石油醚提取物化學(xué)成分，評(píng)價(jià)其抗炎活性。方法 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）對(duì)夏枯草果實(shí)的化學(xué)成分進(jìn)行分析。建立RAW264.7細(xì)胞炎癥模型，評(píng)價(jià)其抗炎效果。結(jié)果 共鑒定夏枯草果實(shí)石油醚提取物中19個(gè)化學(xué)成分?？寡谆钚园l(fā)現(xiàn)，夏枯草果實(shí)石油醚提取物均具有明顯的抗炎效果。結(jié)論 夏枯草果實(shí)石油醚提取物成分及抗炎活性均具一定差異性。

〔關(guān)鍵詞〕 夏枯草果實(shí);石油醚提取物;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;抗炎

〔中圖分類號(hào)〕R284.1;R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.009

〔Abstract〕 Objective To characterize the chemical constituents of petroleum ether extract from prunella vulgaris L. fruit， and to evaluate its anti-inflammatory activity. Methods GC-MS was used to detect the chemical constituents of the fruits of prunella vulgaris L. The RAW264.7 cell inflammation model was established， and its anti-inflammatory effect was evaluated. Results A total of 19 chemical compounds were identified from Prunella vulgaris L. The research on anti-inflammatory activity found that the petroleum ether extracts of Prunella vulgaris L. had significant anti-inflammatory effects. Conclusion The costituents and anti-inflammatory activities of the petroleum ether extracts of Prunella vulgaris L. have certain differences.

〔Keywords〕 fruit of Prunella vulgaris L.; petroleum ether extract; GC-MS; anti-inflammatory

夏枯草（Prunella vulgaris L.）為唇形科夏枯草屬多年生草本植物，藥用部位為干燥果穗，具有清火、明目、散結(jié)等功效，其主要化學(xué)成分有揮發(fā)油類、多糖類、黃酮類、三萜類等[1-2]。夏枯草為藥食兩用大宗中藥材之一，是中成藥夏枯草膏、夏桑菊顆粒等最為重要的原料藥材，也是王老吉、夏桑菊飲料等涼茶的主要原料藥材，市場(chǎng)需求極大。藥用部位夏枯草果穗在入藥前，通常堆放在倉(cāng)庫(kù)儲(chǔ)存，一段時(shí)間后果穗中的部分果實(shí)散落于地。待果穗入藥之后，通常會(huì)將散落地面的果實(shí)與塵土一起當(dāng)成垃圾丟棄，造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。夏枯草果實(shí)是夏枯草果穗藥用部位的組成之一，夏枯草果穗的活性成分在果實(shí)部位中也有大量分布[3]。因此，本文選擇夏枯草果實(shí)為研究對(duì)象，首先進(jìn)行其石油醚部位的提取，對(duì)提取部位采用GC-MS進(jìn)行成分表征，采用體外炎癥模型對(duì)該提取部位進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，報(bào)道如下。

1 材料

1.1 ?原料

夏枯草采購(gòu)于湖南長(zhǎng)沙高橋藥材市場(chǎng)，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉塔斯教授鑒定為唇形科夏枯草屬植物夏枯草Prunella vulgaris L.，取干燥夏枯草果實(shí)部分;小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 ?主要試劑

無(wú)水乙醇、石油醚、甲醇、正己烷（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;濃硫酸（株洲市星空化玻試劑有限公司）;胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗（鏈霉素、青霉素）、PBS磷酸緩沖液、胰蛋白酶（Hyclone公司）;噻唑藍(lán)、脂多糖、二甲基亞砜（Sigma公司）;細(xì)胞凍存液（NCM bioech）;小鼠TNF-α ELISA 試劑盒、小鼠IL-6 ELISA 試劑盒（聯(lián)科生物科技有限公司）;NO Griess 試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.3 ?主要儀器

分析電子天平（奧多利斯科學(xué)儀器公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;超純水機(jī)（蘇州賽恩斯儀器公司）;高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，日本島津）;多功能酶標(biāo)儀（Thermo公司）;熒光生物顯微鏡（日本OLYMUS）;單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;漩渦混軒逸（上海滬西分析儀器廠）;全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Bio-Rad）。

2 方法

2.1 ?夏枯草果實(shí)石油醚提取物GC-MS指紋圖譜

2.1.1 ?石油醚提取物的提取 ?剝開(kāi)夏枯草果穗取其干燥果實(shí)，粉碎后過(guò)60目篩。取干燥藥材粉末50 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入石油醚（b.p.60～90 ℃）300 mL浸泡1 h，加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至油狀，所得石油醚提取物加入無(wú)水乙醇萃取，冷藏過(guò)夜分層，取上層液減壓濃縮除去乙醇，無(wú)水硫酸鈉干燥即得石油醚提取物[4]。

2.1.2 ?甲酯化前處理 ?10 mg石油醚提取物加

400 μL 1%硫酸-甲醇溶液，于70 ℃水浴鍋加熱30 min，加400 μL 正己烷和1 mL蒸餾水，混勻，靜置分層，取上清液進(jìn)行GC-MS檢測(cè)[5]。

2.1.3 ?GC-MS分析條件 ?色譜柱：DB-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;進(jìn)樣量1 μL;柱溫：起始溫度80 ℃保持2 min，以20 ℃/min的速度升溫至160 ℃，再以8 ℃/min升溫至270 ℃，保持10 min。載氣：高純氦氣（99.999%）;流速1.0 mL/min;分流進(jìn)樣，分流比10∶1;進(jìn)樣口溫度280 ℃;電子轟擊離子源溫度200 ℃;溶劑延遲時(shí)間6.5 min;質(zhì)譜掃描范圍m/z 35～550[6]。

2.2 ?抗炎能力測(cè)定

2.2.1 ?MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性 ?取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)種于96孔板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。分為正常組、模型組、藥物組（濃度梯度為100.00、50.00、25.00、12.50、 6.25 μg/mL）。正常組與模型組加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)基，藥物組每孔給藥100 μL，藥物組的每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，給藥2 h后藥物組與模型組加入100 μL 0.1 μg/mL的脂多糖，孵育24 h后每孔加入噻唑藍(lán)，4 h后每孔加入150 μL二甲基亞砜搖床避光低速振蕩15 min。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm測(cè)量吸光值A(chǔ)，計(jì)算細(xì)胞存活率[7-8]。

2.2.2 ?炎癥因子含量檢測(cè) ?各組細(xì)胞上清液經(jīng)300×g離心10 min，收集上清。按照ELISA與Griess試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)IL-6、TNF-α及NO含量進(jìn)行測(cè)定[9-11]。

3 結(jié)果

3.1 ?GC-MS測(cè)定結(jié)果

3.1.1 ?提取率 ?根據(jù)“2.1.1”石油醚提取物的提取方法得到夏枯草果實(shí)石油醚提取物，夏枯草果實(shí)得到石油醚提取物3.0 g，其提取率為6.0%。

3.1.2 ?成分分析 ?對(duì)夏枯草果實(shí)石油醚提取物GC-MS數(shù)據(jù)分析，得到夏枯草果實(shí)石油醚提取物主要成分為脂肪酸，共鑒定出19種化學(xué)成分，分別為2-十二烯基-1-琥珀酸酐、壬醛二甲基縮醛、肉豆蔻酸、9-十六烯酸、十六烷酸、亞麻酸、硬脂酸、亞油酸乙酯、11，13-二十碳二烯酸、順11-二十烯酸、十八甲基癸酸、13-二十二碳烯酸、二十二烷酸、15-十四烯酸、二十四烷酸、角鯊烯、4，4，6a，6b，8a，11，11，14b-Octamethyl-1，4，4a，5，6，6a，6b，7，8，8a，9，10，11，12，12a，14，14a，14b-octadecahydro-2H-picen-3-one、己二酸、β-生育酚。見(jiàn)表1和圖1。

3.2 ?抗炎能力測(cè)定結(jié)果

3.2.1 ?藥物濃度篩選 ?取不同濃度（100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μg/mL）夏枯草果實(shí)石油醚提取物刺激小鼠巨噬細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藥物濃度小于25 μg/mL時(shí)基本無(wú)細(xì)胞毒性，即小于25.00 μg/mL為藥物的最佳濃度范圍。見(jiàn)圖2。

3.2.2 ?藥物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α及NO的影響 ?在藥物的最佳濃度范圍選擇3個(gè)濃度，即25.00、12.50、6.25 μg/mL，收集3個(gè)濃度上清液進(jìn)行炎性因子檢測(cè)。由圖3可知，模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α含量與正常組具有非常顯著性差異（P<0.01），NO含量與正常組具有顯著性差異（P<0.05）。將樣品與模型組進(jìn)行比較，藥物組與模型組在3個(gè)炎性因子表達(dá)比較中大多具非常顯著性差異（P<0.01），說(shuō)明夏枯草果實(shí)石油醚提取物可顯著抑制由LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α及NO炎性因子。見(jiàn)圖3。

4 討論

夏枯草以果穗入藥前需曬干，在曬干過(guò)程中，大量果實(shí)散落于地上，通常這些果實(shí)與塵土一起當(dāng)成垃圾丟棄，造成資源浪費(fèi)。有研究[3]表明夏枯草果實(shí)的抗氧化活性比果穗高，為了進(jìn)一步利用夏枯草藥用部位資源，對(duì)夏枯草果實(shí)進(jìn)行成分表征和活性評(píng)價(jià)顯得尤為重要。本研究以夏枯草果實(shí)石油醚提取物為研究對(duì)象，對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行表征，且進(jìn)行抗炎活性研究。夏枯草果實(shí)得到石油醚提取物3.0 g，石油醚提取物提取率為6.0%。通過(guò)GC-MS檢測(cè)，得到夏枯草果實(shí)石油醚提取物主要成分為脂肪酸，共鑒定出19種化學(xué)成分，分別為2-十二烯基-1-琥珀酸酐、壬醛二甲基縮醛、肉豆蔻酸、9-十六烯酸、十六烷酸、亞麻酸、硬脂酸、亞油酸乙酯、11，13-二十碳二烯酸、順11-二十烯酸、十八甲基癸酸、13-二十二碳烯酸、二十二烷酸、15-十四烯酸、二十四烷酸、角鯊烯、4，4，6a，6b，8a，11，11，14b-Octamethyl-1，4，4a，5，6，6a，6b，7，8，8a，9，10，11，12，12a，14，14a，14b-octadecahydro-2H-picen-3-one、己二酸、β-生育酚。采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型，檢測(cè)夏枯草果實(shí)石油醚提取物的抗炎效果，夏枯草果實(shí)石油醚提取物能顯著抑制由LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α及NO炎性因子，具有較好的抗炎效果。

由于實(shí)驗(yàn)收集的夏枯草樣本有限，且還存在不同年限、存儲(chǔ)時(shí)間等的影響，因此，課題組擬進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，采用體內(nèi)外炎癥模型結(jié)合譜效相關(guān)性，探索和驗(yàn)證夏枯草果實(shí)石油醚提取物得率、成分及活性，以期為夏枯草果實(shí)的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] RAAFAT K， WURGLICS M， SCHUBERT-ZSILAVECZ M. Prunella vulgaris L. active components and their hypoglycemic and antinociceptive effects in alloxan-induced diabetic mice[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2016， 84： 1008-1018.

[2] QU Z， ZHANG J， YANG H， et al. Prunella vulgaris L.， an edible and medicinal plant， attenuates scopolamine-induced memory impairment in rats[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2016， 65（2）： 291-300.

[3] 馮偉紅，李 ?春，信偉梅，等.生物測(cè)定法用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的探索研究——以夏枯草抗氧化活性與總酚酸含量相關(guān)性的研究為例[J]. 中國(guó)中藥雜志，2016，41（14）：2660-2668.

[4] 白發(fā)平，胡 ?靜，吉 ?敬，等.水蒸氣蒸餾聯(lián)合頂空進(jìn)樣氣質(zhì)聯(lián)用分析夏枯草揮發(fā)油成分[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2019，12（2）：182-185.

[5] 陳新煥，張 ?瑩，李擁軍，等.GC-MS法分析植物油酸中的脂肪酸[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2001，17（5）：438.

[6] 雷思敏.夏枯草果實(shí)的成分分析及其抗炎抗氧化活性研究[D].長(zhǎng)沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2019.

[7] KWON O K， LEE M Y， YUK J E， et al. Anti-inflammatory effects of methanol extracts of the root of Lilium lancifolium on LPS-stimulated Raw264.7 cells[J]. Journal of Ethnopharmacology， 130（1）： 28-34.

[8] XU J， ZHAO Y， AISA H A. Anti-inflammatory effect of pomegranate flower in lipopolysaccharide （LPS）-stimulated RAW264.7 macroph-ages[J]. Pharmaceutical Biology， 55（1）： 2095-2101.

[9] WEI H， HU S， SU Z， et al. Myricetin attenuates LPS-induced Inflammation in RAW 264.7 macrophages and mouse models[J]. Future Medicinal Chemistry， 2018， 10（19）： 2253-2264.

[10] KANG N， CHANG K J， PARK S Y， et al. Anti-inflammatory Effects of Galactose-Taurine Sodium Salt in LPS-Activated RAW 264.7 Cells[J]. Advances in Experimental Medicine & Biology， 2017： 943-953.

[11] LI G， WANG J， JIN M， et al. A new pentacyclic triterpenoid from the leaves of Rhododendron dauricum L. with inhibition of NO production in LPS-induced RAW 264.7 cells[J]. Natural Product Research， 2019： 1-7.