段建興 劉文軍 曾躍勤 張高飛 王 迪 李佳美 婁涵瀟

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院燒傷科，云南 昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)分子臨床醫(yī)學(xué)研究院，云南 昆明 650500）

大面積深度燒傷創(chuàng)面中的組織變性和壞死是燒傷后全身嚴(yán)重炎癥反應(yīng)的始動因素，燒傷后由于皮膚屏障的破壞導(dǎo)致感染的侵襲及應(yīng)激性反應(yīng)可持續(xù)活化全身炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，造成患者多器官功能衰竭[1]。研究表明休克期切痂能夠減輕氧自由基的損傷，糾正血流動力學(xué)紊亂，減少炎癥因子的產(chǎn)生，控制及減輕感染的發(fā)生[2]，故及早進(jìn)行創(chuàng)面切痂手術(shù)能夠減少燒傷患者的炎癥因子活化。研究顯示，肝臟與嚴(yán)重?zé)齻笕硌装Y因子的產(chǎn)生有重要關(guān)系，肝臟中含有人體內(nèi)最大的固有巨噬細(xì)胞群——庫普弗細(xì)胞群（Kupffer cells），當(dāng)機體遭受嚴(yán)重?zé)齻笾嗵堑扔泻σ蜃涌芍苯哟碳せ罨摷?xì)胞群，釋放大量的炎癥因子[3-4]，且該過程與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路密切相關(guān)[5]。因此肝臟可能是嚴(yán)重?zé)齻蠡颊叱霈F(xiàn)全身炎癥聯(lián)級反應(yīng)的主要起發(fā)點。熱力損傷后的組織細(xì)胞可釋放大量的炎癥介質(zhì)[6]。這些炎癥介質(zhì)通過活化肝臟MAPK 通路可釋放大量的炎癥因子，早期切痂封閉創(chuàng)面理論上能夠從源頭上減少這些炎癥介質(zhì)的釋放從而減少炎癥因子的產(chǎn)生，但具體機制還不明了。本研究通過觀察休克期切痂后體循環(huán)血清炎癥因子的改變，并探討燒傷后炎癥因子的主要釋放器官肝臟中炎癥信號通路p38MAPK/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的表達(dá)變化，旨在為燒傷后適宜休克期切痂進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 動物模型復(fù)制、分組與處理方法 雄性SPF 級SD 大鼠68 只作為受體實驗動物，體質(zhì)量230 ～250 g（其中3 只實驗過程中死亡）。雄性SPF 級Wistar 大鼠23 只作為異體皮供體，體質(zhì)量230 ～250 g，術(shù)前禁食12 h、禁水4 h。異體皮的制備：Wistar 大鼠用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，背部剃毛，用Veet 脫毛膏再次脫毛，消毒后用手術(shù)刀切取全層皮膚，面積約25%TBSA，切下來的皮膚修去多余的筋膜，0.5%碘伏中浸泡5 min，無菌生理鹽水沖洗備用。SD 大鼠隨機分為模型組、切痂組、假手術(shù)組。模型組：將大鼠麻醉，背頸部同樣方法脫毛后浸入98 ℃水浴鍋中10 s 造成30% TBSA Ⅲ度燒傷，傷后立即腹腔注射生理鹽水（50 ml/kg）補液抗休克。切痂組：大鼠處理方法同模型組，燙傷后12 h行切痂手術(shù)并使用異體皮縫合覆蓋。假手術(shù)組：大鼠脫毛后浸入37 ℃水浴鍋中10 s，并腹腔注射生理鹽水（50 ml/kg）模擬抗休克，12 h 后模擬切痂手術(shù)及自體皮覆蓋縫合。模型組分別在燙傷后12、24、48、72、96 h 取材，切痂組和假手術(shù)組分別在燙傷后24、48、72、96 h 取材，每個時相點5 只。

1.2 標(biāo)本收集 SD 大鼠于各個觀察時相點麻醉后斷頭處死取血，收集新鮮血液約2 ml，室溫靜置30 min，待血液分層后4℃、8 000 r/min 離心10 min，吸取上層血清分裝，-80 ℃保存，取血的同時立即切取部分肝臟，-80 ℃保存待檢。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測血清炎癥因子—內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(LBP)、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-10 試劑盒分別由武漢云克隆科技股份有限公司、杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司提供，按照試劑盒說明書進(jìn)行，按照特定波長使用SpectraMax M2 檢測每孔吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對每孔各炎癥因子進(jìn)行定量分析。

1.3.2 Western blot 檢測大鼠肝臟p38MAPK/NF-κB 通路表達(dá)蛋白 取凍存的肝臟組織30 mg放入玻璃勻漿器中，加入200 μl 強裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）及磷酸酶抑制劑A、B 液各8 μl（賽維爾公司提供），勻漿后冰上放置10 min，4 ℃超高速離心機10 000 r/min 離心10 min 后取部分中間液體，利用BCA 蛋白濃度測定試劑盒（賽維爾公司提供）檢測蛋白濃度并計算上樣體積，按4 ∶1 的比例加入蛋白上樣緩沖液（還原型）混勻后放入金屬水浴鍋中，100 ℃煮5 min 進(jìn)行蛋白變性，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。配制分離膠及壓縮膠加入電泳液，每個膠孔分別加入Marker 及樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢，根據(jù)目的蛋白及內(nèi)參的相對分子質(zhì)量切取相應(yīng)的凝膠，再將凝膠上的目的蛋白進(jìn)行濕轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯（PVDF）上，使用含5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST 封閉2 h，用含兔源一抗p38 MAPK(1:1 000)、磷酸化p38 MAPK （p-p38 MAPK）Thr180/Tyr182（1:1 000）、磷酸化-NF-κB（p-NF-κB） p65 Ser536（1:1 000）的2% BSA（TBST 配制）進(jìn)行孵育，4 ℃過夜，取出PVDF膜，使用TBST 放在搖床上洗滌5 min，共洗5次，再使用二抗抗兔IgG-HRP-抗體（1:2 000）室溫?fù)u床上孵育1 h（以上一抗及二抗均由Cell Signaling Technology 提供），用上述方法再次用TBST 洗滌，取出PVDF 膜，將HRP 化學(xué)發(fā)光顯色液均勻地涂在 PVDF 膜上，使用Bio-rad伯樂凝膠成像儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像，成像后使用Image J 進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用配對t 檢驗，P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清LBP 水平的變化 LBP 在大鼠模型組各時相點與燙傷后12 h 比較均升高，在48 h 時到達(dá)峰值且差異有顯著性（P＜0.05），之后逐漸平穩(wěn)。切痂組在同一時相點與模型組比較，LBP 表達(dá)48 h 時下降最多，差異具有顯著性（P＜0.05），但其余時相點差異沒有顯著性（P＞0.05）；組內(nèi)各時相點比較差異也沒有顯著性（P＞0.05）。假手術(shù)組中各時相點LBP 表達(dá)均比模型組少，在48 h 及96 h時相點比較差異具有顯著性（P＜0.05）；但與切痂組相同時相點比較及組內(nèi)各時相點間比較，差異均無顯著性（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠傷后不同時間血清LBP 水平的比較(，n=5，ng/ml)

表1 各組大鼠傷后不同時間血清LBP 水平的比較(，n=5，ng/ml)

注：與本組傷后12 h 比較：*P＜0.05；與本組傷后24 h 比較：#P＜0.05；與模型組相同時相點比較：Δ P＜0.05

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h模型組 1.49±0.57 2.38±0.64 2.72±0.80*# 2.05±0.50 1.83±0.47切痂組 - 2.10±0.67 1.69±0.55Δ 1.89±0.37 1.78±0.34假手術(shù)組 - 1.79±0.35 1.70±0.29Δ 1.49±0.53 1.34±1.65Δ

2.2 血清HMGB1 水平的比較 模型組各時相點與燙傷后12 h 比較HMGB1 均升高，72 和96 h時差異有顯著性（P＜0.05 和P＜0.01），96 h 達(dá)峰值。與模型組同一時相點比較，切痂組HMGB1 表達(dá)在各個時相點均下降（P＜0.01）；組內(nèi)各時相點之間無明顯變化（P＞0.05）。假手術(shù)組各時相點HMGB1 表達(dá)明顯減少（P＜0.01），組內(nèi)各時相點間比較差異亦無顯著性（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠傷后不同時間血清HMGB1 水平的比較(，n=5，pg/ml)

表2 各組大鼠傷后不同時間血清HMGB1 水平的比較(，n=5，pg/ml)

注：與本組傷后12 h 比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與本組傷后24 h 比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相同時相點比較：ΔΔ P＜0.01；與切痂組相同時相點比較：ΟΟP＜0.01

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h模型組 69.26±3.45 71.80±5.47 70.47±3.11 82.07±7.59*# 87.43±6.66**##切痂組 - 48.74±10.38ΔΔ 52.36±9.51ΔΔ 48.82±4.80ΔΔ 42.91±8.27ΔΔ假手術(shù)組 - 22.04±10.50ΔΔΟΟ 18.70±8.78ΔΔΟΟ 24.07±6.37ΔΔΟΟ 18.39±8.25ΔΔΟΟ

2.3 血清IL-6 水平的比較 IL-6 水平在模型組傷后12 h到達(dá)峰值，96 h時較12 h明顯下降（P＜0.01）。切痂組在相同時相點與模型組比較，IL-6 均下降，在48、72、96 h 差異均具有顯著性（P＜0.05 或P＜0.01）；組內(nèi)比較，傷后72 h 及96 h 較24 h 表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。假手術(shù)組各時相點IL-6表達(dá)均較模型組及切痂組明顯減少（P＜0.01）；組內(nèi)比較，傷后72 h 明顯減少（P＜0.01）。見表3。

2.4 血清TNF-α 水平的比較 TNF-α 水平在模型組24 h 到達(dá)峰值之后逐漸減少，96 h 時較12 h 明顯減少（P＜0.05）。同一時相點切痂組與模型組比較，TNF-α 均顯著減少（P＜0.01）；組內(nèi)比較,96 h 較24 h 明顯減少（P＜0.05）。假手術(shù)組各時相點TNF-α 表達(dá)均比模型組明顯減少（P＜0.01）；而與切痂組比較，48 h 差異有顯著性（P＜0.05）；組內(nèi)比較差異均無顯著性（P＞0.05）。見表4。

表3 各組大鼠傷后不同時間血清IL-6 水平的比較(，n=5，pg/ml)

表3 各組大鼠傷后不同時間血清IL-6 水平的比較(，n=5，pg/ml)

注：與本組傷后12 h 比較：**P＜0.01；與本組傷后24 h 比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相同時相點比較：Δ P＜0.05，ΔΔ P＜0.01；與切痂組相同時相點比較：ΟΟP＜0.01

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h模型組 207.03±16.53 201.97±17.55 184.16±15.30 170.37±37.52 148.87±25.45**##切痂組 - 174.95±34.07 130.41±36.51ΔΔ 123.22±26.91Δ# 193.12±17.56ΔΔ#假手術(shù)組 - 196.15±16.62ΔΔΟΟ 175.69±24.34ΔΔΟΟ 161.64±9.56ΔΔ##ΟΟ 175.08±22.67ΔΔΟΟ

表4 各組大鼠傷后不同時間血清TNF-α 水平的比較(，n=5，pg/ml)

表4 各組大鼠傷后不同時間血清TNF-α 水平的比較(，n=5，pg/ml)

注：與本組傷后12 h 比較：*P＜0.05；與本組傷后24 h 比較：#P＜0.05；與模型組相同時相點比較：ΔΔ P＜0.01；與切痂組相同時相點比較：ΟP＜0.05

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h模型組 116.22±5.98 123.12±7.31 122.22±7.39 113.95±9.25 102.59±7.10*#切痂組 - 181.61±8.62ΔΔ 178.27±4.35ΔΔ 174.67±5.67ΔΔ 168.06±4.60ΔΔ#假手術(shù)組 - 175.51±5.22ΔΔ 170.49±3.75ΔΔΟ 172.31±3.79ΔΔ 171.13±4.21ΔΔ

2.5 血清IL-10 水平的比較 IL-10 水平在模型組24 h 到達(dá)峰值之后有所減少，但在72 h 及96 h 的水平仍高于12 h（P＜0.05 或P＜0.01）。切痂組在同一時相點與模型組比較，除24 h 外，其余時相點均顯著減少（P＜0.01）；組內(nèi)比較，72 h及96 h 均較24 h 減少（P＜0.05）。假手術(shù)組各時相點IL-10 表達(dá)均比模型組明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），而與切痂組比較，除了96 h，其余各時相點均顯著減少（P＜0.05）；組內(nèi)比較，只有72 h 表達(dá)較24 h 顯著減少（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠傷后不同時間血清IL-10 水平的比較(，n=5，pg/ml)

表5 各組大鼠傷后不同時間血清IL-10 水平的比較(，n=5，pg/ml)

注：與本組傷后12 h 比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與本組傷后24 h 比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相同時相點比較：ΔΔ P＜0.01；與切痂組相同時相點比較：ΟΟP＜0.01

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h模型組 35.90±6.62 55.11±13.09 51.95±7.65 52.68±7.63## 53.75±11.80#切痂組 - 55.76±13.07 37.33±9.89ΔΔ 37.77±8.55ΔΔ# 36.08±6.07ΔΔ#假手術(shù)組 - 34.57±6.00ΔΟ 25.63±3.78ΔΔΟ 25.58±3.03ΔΔ#Ο 25.59±2.90ΔΔ

2.6 肝臟p38MAPK 蛋白表達(dá)的比較 模型組組內(nèi)比較，大鼠肝臟p38MAPK 總水平差異無顯著性。切痂組與模型組比較差異沒有顯著性；組內(nèi)比較，切痂組p38MAPK 總水平在96 h 較24 h 顯著減少（P＜0.01）。假手術(shù)組與另兩組相同時相點比較，差異無顯著性；組內(nèi)比較也無顯著變化，見圖1。

2.7 肝臟p-p38MAPK 蛋白表達(dá)的比較 大鼠肝臟磷酸化p-p38MAPK 的表達(dá)在模型組中12 h表達(dá)最高，96 h 時較12 h 明顯減少（P＜0.05）。切痂組在同一時相點與模型組組間比較，各時相點p-p38 MAPK 的表達(dá)均顯著減少（P＜0.05 或（P＜0.01）；組內(nèi)比較，96 h 較24 h 明顯減少（P＜0.05）。假手術(shù)組各時相點p-p38MAPK 的表達(dá)均比模型組及切痂組表達(dá)明顯減少（P＜0.05 或P＜0.01）；組內(nèi)比較差異無顯著性（P＞0.05）。見圖2。

2.8 各組大鼠肝臟p-NF-κB P65 蛋白表達(dá)的比較 大鼠肝臟p-NF-κB P65 的表達(dá)在模型組中各時相點間無明顯差異，但在96 h 時有所減少。切痂組在同一時相點與模型組組間比較，48 h及72 h 均顯著減少（P＜0.01），而在24 h 及96 h 差異無顯著性（P＞0.05）；組內(nèi)比較，72 h 及96 h 均較24 h 顯著減少（P＜0.05 或P＜0.01）。假手術(shù)組中各時相點與模型組比較，差異均有顯著性（P＜0.05 或P＜0.01）；與切痂組相同時相點比較，24 h 及48 h 差異有顯著性（P＜0.05 和P＜0.01）；在組內(nèi)比較中48 h 相對于24 h 呈顯著減少（P＜0.01）。見圖3。

圖1 各組大鼠傷后不同時間p38MAPK 蛋白表達(dá)的比較

圖2 各組大鼠傷后不同時間p-p38MAPK 蛋白表達(dá)的比較

圖3 各組大鼠傷后不同時間p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)的比較

3 討 論

燒傷治療一開始建議“保痂”治療，但在保證血流動力學(xué)穩(wěn)定的情況下越來越多的臨床研究提示休克期切痂具有更好的救治效果[7]，原因在于焦痂的存在可能作為創(chuàng)面培養(yǎng)基導(dǎo)致細(xì)菌的侵襲與感染[2]。休克期切痂可以在體液滲出高峰期減少痂下水腫液，阻斷細(xì)菌的繁殖，同時減少液體的重吸收，減少內(nèi)毒素入血[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在傷后6 h 便可能有細(xì)菌在創(chuàng)面繁殖并進(jìn)一步侵入到深部組織，7 ～12 h 血漿中的內(nèi)毒素（LPS）便可到達(dá)高峰且主要來自腸道[9-10]。LPS 結(jié)合血清中的LBP 來尋找目標(biāo)細(xì)胞比如肝臟巨噬細(xì)胞表面的Toll 樣受體（TLR），與受體結(jié)合后聯(lián)級活化p38 并調(diào)節(jié)幾種下游靶標(biāo)，其中一種為NF-κB（p65），可使胞質(zhì)內(nèi)總NF-κB 部分磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，在轉(zhuǎn)錄翻譯后釋放大量的炎癥因子比如IL-1β、 IL-6、TNF-α 和HMGB1 等[11-12]。HMGB1 在燒傷后全身炎癥瀑布反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，可在早期皮膚成纖維細(xì)胞受損后釋放出來并使免疫細(xì)胞聚集[13]，同時有研究發(fā)現(xiàn)HMGB1 可與LPS 協(xié)同增強p38MAPK和NF-κB 的磷酸化水平，從而加重炎癥反應(yīng)[14]。故早期切痂能明顯減少HMGB1 的產(chǎn)生，并有助于預(yù)防多器官功能衰竭[15]。綜上所述，休克期切痂有望從源頭上減少LPS 及HMGB1 的產(chǎn)生并通過調(diào)控肝臟p38MAPK/NF-κB 通路減輕燒傷炎癥反應(yīng)。

本研究中模型組血清LBP 傷后48 h 就到達(dá)高峰且維持較高水平，HMGB1 的表達(dá)也逐漸增加。這兩種炎癥因子協(xié)同增強致使肝臟中的p38MAPK及NF-κB 過度磷酸化，于傷后12 h 及24 h 便產(chǎn)生較多的炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α，組內(nèi)比較中兩者雖在后期有所下降，但沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。當(dāng)在休克期12 h 進(jìn)行切痂手術(shù)后，LBP 在48 h 有一定減少，而在其余時相點的變化均無明顯差異，考慮切痂后短時間內(nèi)雖然阻斷了痂下液體的吸收，但由于腸道菌群的作用，仍保持較高水平。而切痂后HMGB1 無論哪一時相點與模型組比較均呈明顯的下降（P＜0.01），之后由于缺少了HMGB1與LPS 的相互作用，或者減少了痂下液體的回吸收入血，肝臟p38MAPK 及NF-κB 磷酸化水平與模型組比較呈明顯降低，所產(chǎn)生的炎癥因子IL-6 及TNF-α 也呈明顯減少；與本組24 h 比較，切痂組術(shù)后48、72、96 h 血清中的促炎介質(zhì)呈減少趨勢，p38MAPK 及NF-κB 磷酸化水平、炎癥因子與24 h 比較呈下降趨勢，且于96 h 時差異均具有顯著性（P＜0.05 或P＜0.01），而模型組內(nèi)各時相點間沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，表明經(jīng)過切痂手術(shù)后大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)呈現(xiàn)更快的減少趨勢。假手術(shù)組由于沒有熱力損傷，表現(xiàn)出較少的促炎因子水平，炎癥通路磷酸化水平也較低。但炎癥因子的存在證明手術(shù)也是一種致傷因素，會造成一定程度的炎癥反應(yīng)。抗炎因子IL-10 在機體處于抗炎平衡狀態(tài)下時會隨著炎癥因子的增加而增加，平衡打破時炎癥因子增加而IL-10 不增或降低。我們發(fā)現(xiàn)各組IL-10 均隨著炎癥因子的增加而增加，證明在實驗中大鼠體內(nèi)抗炎水平還處于動態(tài)平衡狀態(tài)，并不會因為手術(shù)的進(jìn)行而打破該平衡。

本實驗證實休克期切痂雖不能在早期減少細(xì)菌LPS 的產(chǎn)生，但能通過阻斷肝臟p38MAPK及NF-κB 炎癥通路的活化而減少燒傷炎癥因子HMGB1、IL-6、TNF-α 的產(chǎn)生，而且在切痂后全身炎癥反應(yīng)水平呈現(xiàn)出更快減少的趨勢。本研究尚存在納入樣本量較少、觀察時間較短的不足。對于焦痂及痂下液體的研究，如致炎成分、回吸收高峰期等，今后可以深入研究。