（昭通學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南昭通657000）

腎茶[Clerodendranthus spicatus（Thunb.）C.Y.Wu]為唇形科腎茶屬植物，全世界有5種，我國僅有1種，主要分布于福建、廣東、廣西、海南和云南等省，其中云南西雙版納和思茅腎茶栽培最多[1-2]。腎茶味苦，性涼，主要用于治療急慢性腎炎、膀胱炎、尿路結(jié)石和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)等癥[3]。腎茶中含有黃酮類、酚酸類、萜類及糖苷類等化學(xué)成分[4-8]，具有抗菌[9-10]、抗氧化[11-12]、降血糖[13]、抑制腫瘤[14]等生物活性。目前，對腎茶的研究多集中于酚酸類和黃酮類，對其多糖研究較少。研究表明，從植物中提取的水溶性多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、降血脂、抗病毒、抗腫瘤等功效，且細胞毒性低、安全性強，植物多糖已成為人們研究的熱點[15]。

腎茶多糖存在于腎茶的組織細胞內(nèi)，難以溶出。采用纖維素酶能降解植物細胞中的纖維素，可有效破除細胞壁，使多糖成分溶出。酶法提取植物多糖，提取條件溫和，既能提高多糖得率，又能較好地保持多糖的生物活性[16]。文中對纖維素酶法提取腎茶多糖的工藝進行響應(yīng)面法優(yōu)化，建立腎茶多糖提取方法，并對所得多糖體外抗氧化活性進行評估，以促進腎茶資源的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腎茶：來源于藥用植物研究所云南分所唇形科植物 Clerodendranthus spicatus（Thunb.）C.Y.Wu 的干燥嫩枝葉；纖維素酶（食品級3 000 U/g）：和氏璧生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：分析純，美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BPG-9156A型精密鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-S26s型恒溫水浴鍋：金壇市大地自動化儀器廠；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器有限公司；UV-1800PC型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖標準曲線繪制

根據(jù)文獻[17]，用苯酚-硫酸法繪制多糖標準曲線，得回歸方程y=11.27x-0.020 5，r=0.999 3，線性范圍0～0.008 3 mg/mL。

1.3.2 腎茶多糖的測定

準確移取一定體積多糖提取液，按標準曲線繪制方法測定，計算出腎茶多糖的提取率。

式中：T為多糖提取率，%；C為多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為體系總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 纖維素酶提取法單因素試驗設(shè)計

以纖維素酶為酶制劑，提取腎茶多糖：腎茶→烘干→粉碎過80目篩→加提取液酶解浸提→沸水浴滅活5 min→過濾→濾液濃縮→醇沉→多糖→溶解測定[18]。

1.3.3.1 料液比的選擇

固定酶解時間2 h，酶用量2%（以干樣質(zhì)量百分數(shù)計），酶解溫度55℃，酶解pH 4，考察料液比分別為1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）時，對多糖提取率的影響。

1.3.3.2 酶用量的選擇

固定料液比 1 ∶30（g/mL），酶解 pH 4，酶解溫度55℃，酶解時間2 h，考察酶用量分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%時，對多糖提取率的影響。

1.3.3.3 酶解pH值的選擇

固定料液比 1∶30（g/mL），酶解溫度 55℃，酶解時間2 h，酶用量2%，考察酶解pH值分別為3、4、5、6、7時，對多糖提取率的影響。

1.3.3.4 酶解溫度的選擇

固定料液比 1 ∶30（g/mL），酶解時間 2 h，酶用量2%，酶解 pH 4，考察酶解溫度分別為 25、35、45、55、65℃時，對多糖提取率的影響。

1.3.3.5 酶解時間的選擇

固定料液比 1∶30（g/mL），酶解溫度 55℃，酶用量 2%，酶解 pH 4，考察酶解時間分別為 0.5、1、1.5、2、2.5 h時，對多糖提取率的影響。

1.3.4 纖維素酶響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對腎茶多糖提取率影響較大的酶用量、酶解pH值、酶解溫度、酶解時間4個因素進行響應(yīng)面試驗，分析優(yōu)化腎茶多糖的纖維素酶法提取工藝。

1.3.5 水提取法

前期試驗研究表明以去離子水為溶劑，料液比1∶30（g/mL），90℃水浴浸提 2 h，提取液濃縮醇沉所得腎茶多糖含量較高，以此條件提取腎茶多糖。

1.3.6 腎茶多糖抗氧化活性測定

采用文獻[19]的方法，通過DPPH自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）清除法以及普魯士藍法測定腎茶多糖的抗氧化能力，并以維生素C做陽性對照進行比較。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均平行測定3次，采用origin75和Design-Expert.V8.0.6軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶法提取單因素試驗

2.1.1 料液比對腎茶多糖提取率的影響

料液比對腎茶多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對腎茶多糖提取率的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on extraction yield of polysaccharides from C.spicatus

由圖1可知，腎茶多糖提取率隨著料液比的增大而增大，當料液比高于1∶30（g/mL）時，多糖提取率開始下降。這是由于增大溶劑量，使得腎茶顆粒與溶劑充分接解，促進了多糖的溶出，但當溶劑量過大時，腎茶顆粒中的其他雜質(zhì)成分也會參與溶出，使得多糖提取率下降，因此，確定料液比為1∶30（g/mL）。

2.1.2 酶用量對腎茶多糖提取率的影響

酶用量對腎茶多糖提取率的影響見圖2。

圖2 酶用量對腎茶多糖提取率的影響Fig.2 Effect of cellulase amount on extraction yield of polysaccharides from C.spicatus

由圖2可知，腎茶多糖的提取率隨著酶用量的增加而增大，當酶用量達2.0%時，酶與底物充分接觸，酶能有效分解細胞壁，使得多糖更易溶出，提取率達到最高。當繼續(xù)增加酶用量，過量的酶會包裹腎茶顆粒表面，阻礙多糖進一步溶出，多糖提取率下降[20]。因此，適宜的酶用量為2.0%。

2.1.3 酶解pH值對腎茶多糖提取率的影響

酶活力顯著受pH值影響，每種酶都有其作用的最適pH值。酶解pH值對腎茶多糖提取率的影響見圖3。

圖3 酶解pH值對腎茶多糖提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on extraction yield of polysaccharides from C.spicatus

由圖3可知，當提取液pH值為4時，腎茶酶解效率最佳，多糖提取率最高，表明纖維素酶在偏酸性條件下酶活力較強，之后隨著提取液pH值增大，酶活力減弱，酶解效率降低[21]，多糖提取率下降，故選酶解pH值為4。

2.1.4 酶解溫度對腎茶多糖提取率的影響

酶解溫度對腎茶多糖提取率的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對腎茶多糖提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on extraction yield of polysaccharides from C.spicatus

結(jié)果顯示，多糖提取率隨著酶解溫度的升高而逐漸增大，酶解溫度在55℃時，多糖提取率達到最大，之后隨著酶解溫度的升高，多糖提取率迅速下降。酶是一類具有適宜溫度范圍的蛋白質(zhì)，酶解溫度過低，酶的催化活性被抑制，酶解溫度過高，酶蛋白質(zhì)變性而失活[21]。所以，確定酶解溫度為55℃。

2.1.5 酶解時間對腎茶多糖提取率的影響

酶解時間對腎茶多糖提取率的影響見圖5。

結(jié)果顯示，腎茶多糖的提取率隨著酶解時間的延長而增大，酶解2 h時，多糖提取率最大，超過2 h，多糖提取率急速下降。酶解2 h，酶解充分，多糖能最大限度溶出，酶解時間過長，酶開始失活，并且部分多糖會被水解，多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生降解，導(dǎo)致多糖提取率減小。因此，酶解時間確定為2 h。

2.2 纖維素酶響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果分析

以酶用量、酶解pH值、酶解溫度、酶解時間為自變量，腎茶多糖提取率為響應(yīng)值，進行四因素三水平響應(yīng)面試驗。試驗因素與水平見表1，試驗設(shè)計與結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面法試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experlmental design and results for response surface methodology

表2中的試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Desing-Expert.V8.0.6軟件分析擬合，得到腎茶多糖提取率的多元回歸方程：Y=12.41+0.16A-0.36B-0.62C+0.16D+0.72AB+0.17AC+0.060AD-0.18BC+0.18BD-0.31CD-0.56A2-1.04B2-1.06C2-0.41D2。

對上述模型進行方差分析，結(jié)果如表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

結(jié)果表明，此模型的P值小于0.000 1，響應(yīng)面回歸模型極顯著；失擬項P值為0.515 5大于0.05，不顯著，表明所建模型擬合程度良好。回歸模型相關(guān)系數(shù)R2為0.904 5，反映該線性回歸模型能在90.45%程度上解釋反應(yīng)變量Y的變異性。由顯著性水平檢驗可知，B、C、AB、A2、B2、C2項對響應(yīng)值影響極顯著 （P＜0.01）；D2對響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05）；A、D、AC、AD、BC、BD、CD項對響應(yīng)值影響不顯著，表明試驗因素對多糖提取率的影響不是簡單線性關(guān)系。從F值可知，影響腎茶多糖提取率的因素強弱順序為C（酶解溫度）>B（酶解pH值）>A（酶用量）>D（酶解時間）。

2.2.2 交互作用分析

由回歸方程繪制響應(yīng)面和等高線圖，如圖6所示。

從圖6中可以看出，酶用量、酶解pH值、酶解溫度和酶解時間4個因素中任意2個因素之間的交互作用，除酶用量和酶解pH值交互作用顯著外，其余交互作用不顯著。在酶用量和酶解pH值等高線圖中可以看出，酶用量在1.5～2.5%，酶解pH值在3～5范圍內(nèi)，腎茶多糖提取容易達到最大值，最大值在其圓心處。酶解pH值的變化要比酶用量的變化對多糖提取率的影響更明顯。

圖6 各因素交互作用對腎茶多糖提取率的影響Fig.6 Effects of factors interactive on extraction yield of polysaccharides from C.spicatus

2.2.3 最佳工藝驗證

由Desing-Expert.V8.0.6軟件優(yōu)化分析，得到腎茶多糖最優(yōu)提取條件為酶用量2.02%，酶解pH3.90，酶解溫度51.76℃，酶解時間2.15 h，此時腎茶多糖的提取率為12.55%?？紤]到實際操作的簡便性，將工藝條件修正為酶用量2%，酶解pH3.90，酶解溫度52℃，酶解時間2h，進行3次平行試驗，測得腎茶多糖平均提取率為12.51%，與理論預(yù)測值相比，相對誤差為0.32%，表明該模型具有實際應(yīng)用價值。

按料液比1∶30（g/mL），在腎茶粉末中加入去離子水，于90℃水浴浸提2 h，多糖提取率為8.29%，較纖維素酶法多糖提取率低，酶提多糖約是水提多糖的1.5倍，表明酶提法優(yōu)于水提法。纖維素酶能有效降解植物細胞中的纖維素，提高多糖溶出率。

2.3 腎茶多糖抗氧化活性分析

2.3.1 清除DPPH·活性

腎茶多糖及維生素C對DPPH·的清除活性如圖7所示。

圖7 腎茶多糖對DPPH·的清除作用Fig.7 Scavenging effect of polysaccharides from C.spicatus on DPPH·

從圖7可知，隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，酶提多糖和水提多糖清除DPPH·能力增強。酶提多糖與水提多糖清除DPPH·的IC50值分別為33.14 μg/mL和40.59 μg/mL，酶提多糖清除DPPH·能力強于水提多糖，表明酶法提取條件溫和，避免高溫浸提導(dǎo)致多糖水解，較好地保持了多糖的生物活性。但兩種提取方法所得多糖對DPPH·的清除能力均弱于維生素C（IC50值為5.77 μg/mL），這可能與試驗所得多糖的純度、清除機制等因素有關(guān)。

2.3.2 清除·OH的活性

腎茶多糖及維生素C對·OH的清除活性如圖8所示。

圖8 腎茶多糖對·OH的清除作用Fig.8 Scavenging effect of polysaccharides from C.spicatus on·OH

結(jié)果顯示，在設(shè)置的試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，酶提多糖和水提多糖都能劑量依賴性地清除·OH，其IC50值分別為0.64、0.82 mg/mL，酶提多糖對·OH的清除能力相對較強，但均弱于維生素C（IC50值為0.16mg/mL）。

2.3.3 還原活性

腎茶多糖及維生素C的還原活性如圖9所示。

圖9 腎茶多糖的還原能力Fig.9 Reducing ability of polysaccharides from C.spicatus

結(jié)果顯示，隨著多糖質(zhì)量濃度增加，吸光度增大，還原能力增強，說明多糖質(zhì)量濃度與多糖還原能力呈正相關(guān)。不同提取方法所得多糖的還原能力不同，相較于水提多糖，酶提多糖的還原能力較強，但酶提和水提多糖的還原能力均低于維生素C。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化腎茶多糖的纖維素酶法提取工藝，并與水提法相比較。結(jié)果表明，料液比1 ∶30（g/mL），酶用量 2%，酶解 pH3.90，酶解溫度52℃，酶解時間2 h，腎茶多糖提取率為12.51%，優(yōu)于水提法（8.29%）。通過清除DPPH·、·OH和普魯士藍法測定腎茶多糖的抗氧化活性，結(jié)果顯示腎茶多糖對自由基的清除作用及還原能力隨其濃度的增大而增強。說明腎茶多糖具有較好的抗氧化活性，且酶提多糖的抗氧化活性強于水提法。此試驗所得多糖未經(jīng)純化，為粗多糖，其雜質(zhì)成分如蛋白質(zhì)、色素等會干擾多糖的抗氧化作用。下步試驗將進一步對所提多糖純化，并研究其與抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系，為腎茶在天然抗氧化功能產(chǎn)品領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。