徐久婷，韓曉婷，楊培華，魯周民

（西北農(nóng)林科技大學林學院，陜西咸陽712100）

枇杷[Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.]是一種觀賞樹木，屬于薔薇科，四季常綠同時造型美觀。我國栽培枇杷至今已有兩千多年[1]，最早由原生種經(jīng)過多年進化后形成栽培品種，我國長江以南省份適宜種植枇杷，且有著大面積的種植[2]，從營養(yǎng)價值來看，其中所包含的營養(yǎng)成分能夠滿足人體的多方面需求，具有非常高的醫(yī)藥價值，枇杷的葉、果實、種子以及花等都可以作為藥材[3]。枇杷干燥葉是我國一味中藥，功效為止咳、消炎[4-5]，也可以對全身性蕁麻疹、關節(jié)炎等疾病治療[6]。目前已經(jīng)從枇杷葉中提取出了黃酮、多糖、總酚等化學物質(zhì)，黃酮具有抗氧化、降血脂、增強免疫力等功效[7-9]，多酚則有著抑菌、清除自由基等功效[10-12]，多糖有著降血糖以及抗輻射等方面的功效[13-15]。因此，對枇杷葉主要功能成分的開發(fā)利用，具有重要的經(jīng)濟和社會效益。

目前，在枇杷葉有效成分的提取中，大多采用某一種乙醇濃度進行提取，多集中于60%、70%濃度的乙醇[5，9，16]，而對于不同乙醇濃度條件下提取枇杷葉主要功能成分的效果差異以及對于某種具體成分的提取適宜濃度的研究還未見報道。

本文以水提取作為對照，通過設置不同濃度的乙醇提取液，研究不同乙醇浸提濃度對多糖、總酚、黃酮的提取效果及對抗氧化性指標的影響，探討乙醇濃度對枇杷葉主要功能成分的提取規(guī)律以及適于不同成分的提取濃度，為優(yōu)化枇杷葉主要功能成分提取方法提供技術參考，從而達到最大的經(jīng)濟和社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮成熟枇杷葉：于2018年9月，采自西北農(nóng)林科技大學南校區(qū)的枇杷園。

蘆丁標準品、Trolox標準品、二硫代蘇糖醇、ABTS、蒽酮標準品、DPPH：上海藍季生物科技有限公司；福林酚：上海荔達生物科技有限公司；氯化鐵、氯化鉀、過硫酸鉀、氯化鈉：國藥集團化學試劑公司；沒食子酸、碳酸鈉、乙醇、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀：廣東光華科技股份有限公司；鹽酸、醋酸鈉：天津光復精細化工研究所。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

數(shù)控超聲波清洗器（KH-500DE型）：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；粉碎機（JYL-C002E）：九陽股份有限公司；雙杰系列電子天平（JJ200B）：美國雙節(jié)集團有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-S24型）、電熱恒溫鼓風干燥箱（DGG-9140A型）：上海森信實驗儀器有限公司；醫(yī)用離心機（H1850）：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 試驗方法

采摘新鮮枇杷葉清洗干凈后，在65℃條件下進行烘干，直到質(zhì)量不再發(fā)生變動，然后進行粉碎，使用60目篩過濾，篩后的干粉放置在干燥器內(nèi)備用。

準確稱取8份于65℃條件下烘干樣品干粉各0.5g，加入50 mL的離心管內(nèi)，依次加入濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的 30 mL乙醇溶液，以蒸餾水作為對照，密封搖勻后超聲浸提，功率100 Hz、溫度30℃，浸泡時間為10 min，并浸提2次經(jīng)過離心處理后得到上清液，放在-4℃冰箱里作為備用，重復上述3次處理流程。

1.4 指標測定方法

1.4.1 總酚的測定

采用Folin-Ciocalteu方式測定總酚[17-18]，在待測液中提取0.1 mL溶液放入25 mL具塞試管，加入水稀釋到1 mL，再添加20%1.5 mL的Na2CO3溶液與0.5 mL的福林酚溶液，定容到15 mL，充分搖勻靜置1 h，放置在760 nm處對吸光值測量。

選擇的標準品為沒食子酸，繪制在0～0.012 mg/mL區(qū)間內(nèi)的標準曲線，求得線性回歸方程，為y=74.679x+0.010 5，R2=0.999 2。

1.4.2 多糖的測定

采用蒽酮比色法[19]測定多糖含量，取出0.1 mL的待測樣品并加入到試管中，并加入蒽酮顯色劑5 mL，然后進行沸水浴，持續(xù)10 min的時間將其冷卻，并置于625 nm測定吸光值。

處于0～0.12 mg/mL區(qū)間內(nèi)，選取葡萄糖溶液標準品，然后進行標準曲線的繪制。根據(jù)上述操作測定吸光值，回歸方程為y=7.617 9x+0.018 6，R2=0.997 5。

1.4.3 黃酮的測定

黃酮的測定采用NaNO2-Al（NO3）3法[20-23]，取400μL樣品浸提液，取已經(jīng)兩倍稀釋的溶液200 μL，將其加入試管，之后則在試管中加入NaNO2溶液600 μL，搖勻，并靜置5 min，之后取Al（NO3）3溶液600 μL加入試管，然后靜置6 min，取4%的NaOH溶液1.8 mL，并在加入后靜置15 min，在進行吸光值測量時，以510 nm為測定位置來測定。

以蘆丁為標準品，選定0～2.0 mg/mL范圍，并進行標準曲線的繪制。就能夠得到對應的線性回歸方程，可表示為 y=0.394 7x+0.011 4，R2=0.993 3。

1.4.4 DPPH法測自由基清除能力

DPPH法測自由基清除能力參照文獻[1，24-26]，調(diào)整用量后取0.1 mL已稀釋10倍的樣品浸提液，加入無水乙醇使之達到4 mL，選擇DPPH溶液，測定其濃度為0.1 mmol/L，搖勻后避光0.5 h進行化學反應，選擇在510 nm處進行測定其吸光值（A1）。然后測定0.1 mL溶液與4 mL DPPH溶液混合液的吸光值（A0），對其清除率（K）以下列公式來計算得到：

選擇0～800 μmol/mL的濃度Trolox溶液作為本試驗的標準品，進行標準曲線的繪制。最終計算得到了以下的線性回歸方程：y=0.000 6x+0.005，R2=0.998 9。

1.4.5 FRAP法測總還原力

FRAP法測總還原力參照文獻[27]，取600 μL稀釋100倍后樣品浸提液于試管中，添加4.5 mL的FRAP工作液，升高溫度至37℃，工作液中有著三類溶液，分別為 10 mmol/LTPTZ、20 mmmol/L FeCl3和醋酸鹽緩沖液300 mmol，其體積比為1∶1∶10，將混合液放在37℃的環(huán)境下，維持10 min的反應時間，在593 nm處進行其吸光值的測定。

選擇標準品為Trolox溶液，選取濃度在0～400 μmol/L區(qū)間內(nèi)繪制相應標準曲線，即可得到線性回歸方程，表示為y=0.003 8x+0.048 6，R2=0.993 6。

1.4.6 ABTS法測定自由基清除能力

以ABTS法進行測定自由基的清除能力[25，27-28]，稍加改動使用量，取出相同體積的2.45 mmol/L K2S2O8溶液與7 mmol/L的ABTS溶液，相互反應12 h～16 h后即可獲得ABTS+儲備液，使用10 mmol/L磷酸緩沖鹽溶液對其稀釋40倍后得到ABTS+反應液，并在734 nm處對吸光值（A0）測量。提取100 μL樣品浸提液，將其濃度稀釋100倍后放置在試管內(nèi)，然后將ABTS+反應液3.9 mL加入其中，并置于37℃的水浴環(huán)境下，維持10 min，選擇在734 nm處進行對應的吸光值（A1）的測定。采用下列公式求解ABTS+·清除率（K）值：

選擇的標準品溶液為Trolox，并繪制濃度為0～800 μmol/L區(qū)間內(nèi)的標準曲線。得到線性回歸方程為y=0.000 9x-0.012 1，R2=0.996 7。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

通過Excel2010與SPSS23.0進行統(tǒng)計分析、相關性分析以及差異性分析已提取的數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 乙醇濃度對主要功能指標影響分析

2.1.1 總酚含量隨乙醇濃度變化分析

通過不同乙醇濃度對總酚的提取效果研究，結果見圖1。

隨著乙醇濃度的增加，總酚含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在乙醇濃度50%時達到最大值，提取含量為（0.004 5±5.57×10-5）mg/mL，結果顯示與其他組相比較高（P＜0.05）。70%乙醇浸提液中總酚量小于50%浸提液含量，為（0.003 8±2.89×10-5）mg/mL，對照組水提取的總酚含量最低，為（0.001 7±8.78×10-5）mg/mL。

2.1.2 多糖含量隨乙醇濃度變化分析

多糖含量隨乙醇濃度變化見圖2。

在提取液中，多糖含量隨著乙醇濃度的增加呈先升高后下降的變化趨勢，與總酚含量變化大致相同。在乙醇濃度為50%的浸提液多糖含量最高，達（0.046±4.97×10-4）mg/mL，顯著高于其他組（P＜0.05）。而水提取的多糖含量最小，為（0.019±7.91×10-4）mg/mL。

2.1.3 黃酮含量隨乙醇濃度變化分析

圖3表示改變乙醇濃度后，提取液內(nèi)黃酮含量變化趨勢。

由圖3可得，乙醇濃度升高后黃酮含量變化趨勢出現(xiàn)先增加然后降低，70%濃度乙醇浸提效果為最高水平，含量為（0.859±0.004）mg/mL，50%處的含量為（0.809±0.008）mg/mL，二者差異顯著且均高于其他組（P＜0.05）。

2.2 乙醇濃度對抗氧化性能指標影響分析

2.2.1 DPPH自由基清除率隨乙醇濃度變化分析

通過不同乙醇濃度對DPPH法測自由基清除率效果研究，結果見圖4。

隨著乙醇濃度的增加，自由基清除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，70%濃度的乙醇浸提液自由基清除率最高，為（18.77±0.22）%，顯著高于其他組（P＜0.05），即70%乙醇浸提液抗氧化性能最強。水浸提液的抗氧化性能最差，自由基清除率為（5.84±1.22）%。

圖2 多糖含量隨乙醇濃度變化Fig.2 Polysaccharide content changes with ethanol concentration

圖3 黃酮含量隨乙醇濃度變化Fig.3 Flavonoid content changes with ethanol concentration

圖4 DPPH法測定自由基清除率隨乙醇濃度變化Fig.4 Free radical scavenging rate changes with ethanol concentration by DPPH method

2.2.2 FRAP法測抗氧化活性隨乙醇濃度變化分析

FRAP法測定的抗氧化活性用Torlox含量表示，具體結果見圖5。

由圖5可得，水浸出液抗氧化活性最低，為（50.632±3.974）μmolTEAC/g，隨著乙醇濃度的增加抗氧化活性呈先上升后下降的趨勢，在50%處達到最大值，為（301.684±6.381）μmolTEAC/g，70%乙醇浸出液抗氧化活性稍低于 50%，含量為（239.053±9.604）μmolTEAC/g，二者差異顯著（P<0.05）。

圖5 FRAP法測抗氧化活性隨乙醇濃度變化Fig.5 Antioxidant activity changes with ethanol concentration by FRAP method

2.2.3 ABTS法測自由基清除率隨乙醇濃度變化分析

ABTS法測定自由基清除率隨乙醇濃度變化見圖6。

從圖6中可以看出，ABTS法測定自由基清除率總體趨勢與FRAP法測定結果相似，自由基清除率隨乙醇濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。自由基清除率最大值在50%處，為（8.31±0.51）%，顯著高于其他組（P<0.05）。水浸出液抗氧化活性最低，為（3.07±0.45）%。

圖6 ABTS法測定自由基清除率隨乙醇濃度變化Fig.6 Free radical scavenging rate changes with ethanol concentration by ABTS method

2.3 試驗指標的相關性分析

表1為試驗指標之間的相關性研究，其中主要功能成分含量及抗氧化性能指標的數(shù)據(jù)均為各平行試驗的平均值。

表1 試驗指標之間相關性Table 1 Correlation analysis between text indexes

由表1可得，對于同一類指標來說，主要功能成分中，總酚和黃酮含量具有較高的相關性，得出0.893的相關性系數(shù)；由抗氧化性能指標分析，ABTS+自由基清除率與DPPH自由基清除率間相關性系數(shù)值為0.890；對功能成分比指標與抗氧化性能指標之間的相關性來說，總酚含量與ABTS抗氧化活性間相關性較高，得出相關系數(shù)為0.963，多糖含量與DPPH自由基清除率、ABTS抗氧化活性均存在一定的相關性，相關系數(shù)分別為0.913、0.900。表明總酚、多糖、黃酮均為枇杷葉抗氧化活性的重要成分。

3 結論

對枇杷葉主要功能成分含量的研究中發(fā)現(xiàn)，總體上50%和70%乙醇浸提效果最優(yōu)。其中50%乙醇提取總酚、多糖效果最佳，而70%乙醇提取黃酮含量最多。同樣，對枇杷葉抗氧化活性的分析得出，50%乙醇浸提液和70%乙醇浸提液的抗氧化性能較好。采用DPPH法測自由基清除率時，70%乙醇提取液抗氧化性能最佳，而采用ABTS法與FRAP法時，50%乙醇提取液較佳。因此，提取應用的成分為多糖與總酚時，選取的溶劑為50%乙醇，該濃度溶液提取效果最佳，且投入成本最低。選取黃酮當作提取應用的成分時，提取效果最好的乙醇濃度為70%。試驗研究中，采用60%乙醇濃度的提取結果都表現(xiàn)不佳，對這一結果原因，還需要進一步深入研究。

分析與研究枇杷葉黃酮、總酚、多糖含量與抗氧化活性間的相關性可得，黃酮、多糖含量以及總酚與抗氧化活性間表現(xiàn)出一定相關性，結果顯示黃酮、總酚和多糖均具有抗氧化性能，與吳媛琳等研究結果相似[5]，其中多糖與抗氧化活性的相關性最高。在實際生產(chǎn)中為枇杷葉資源化利用提供理論指導，成為后期研究枇杷葉的關鍵。