王芳 喬美星 喻敏

摘要：采用液體培養(yǎng)的方法，測定了5種抗菌素對豌豆根邊緣細胞培養(yǎng)液污染細菌的抑制和對邊緣細胞的降解作用。結果表明，5種抗菌素在50-4 000 mg/L的濃度梯度內，對邊緣細胞培養(yǎng)液污染細菌均具有一定的抑制作用。其中，羅紅霉素、頭孢呋辛酯和恩諾沙星對污染細菌抑制率較適宜的濃度分別為2 000、1 000和1 000 mg/L，抑制率分別迭93.480-/0、58.70%和91.30%。青霉素、羅紅霉素、頭孢呋辛酯、慶大霉素和恩諾沙星分別在500、500、l 000、1 000和500 mg/L時對邊緣細胞的降解作用較緩慢，分別為63.89%、58.95%、60.80%、73.15%和58.95%，濃度增高，對邊緣細胞的影響會明顯增強。

關鍵詞：抗菌素;污染細菌;邊緣細胞;抑制作用

中圖分類號：TQ455.5

文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020） 08-0080-03

D01：10.1408 8/j.cnki.issn0439- 8114.2020.08.018

在植物組織培養(yǎng)的污染危害中，最嚴重的是細菌污染[1]。染菌的試管苗很難生根[2]，即使生根，移栽成活率也很低，造成無法挽回的損失。細菌污染的消除一般是用抗生素[3]，抗生素可以直接加入到培養(yǎng)基中，也可以用抗生素浸泡外植體或噴灑外植體。

大多數(shù)植物的根尖每天都要代謝產(chǎn)生大量的邊緣細胞（Root border cells，簡稱BC），這些邊緣細胞作為根表面和土壤間構建的一個生物表界面，在減少或避免外界的生物與非生物脅迫，如真菌、細菌、線蟲的侵染和鋁毒的傷害中起著重要作用[4]。絕大多數(shù)物種都有邊緣細胞，且90%以上具有生物學活性，一條根系所產(chǎn)生的邊緣細胞數(shù)量因物種而異。此外，細胞活性受環(huán)境條件、染色及觀察時間等外界因素的影響較大。

邊緣細胞是從根冠表皮游離出來并聚集在根尖周圍的一群特殊細胞。關于邊緣細胞形成和釋放的調控機制以及在提高植物抗逆性，尤其是抗鋁毒方面的研究，已成為植物學研究領域的新熱點之一[5]。本試驗就邊緣細胞的體外培養(yǎng)過程中細菌污染的抑制問題進行了初步探討，旨在為邊緣細胞培養(yǎng)液的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

豌豆由佛山科學技術學院土壤肥料實驗室提供。

藥劑主要有青霉素、羅紅霉素、頭孢呋辛酯、恩諾沙星和慶大霉素。

儀器主要有三角燒瓶、試管、玻璃棒、酒精燈、電子顯微鏡、超凈工作臺。

1.2 方法

1.2.1 豌豆根邊緣細胞的培養(yǎng)選擇飽滿且大小均勻的豌豆種子用0.5%次氯酸鈉殺菌10 min，流水沖洗30 min，再用無菌水沖洗3次，然后在無菌水中浸泡12 h，使其吸脹。采用超聲霧化裝置在恒溫（23℃）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)豌豆幼苗[6.7]，待根長至15 mm以上時分離邊緣細胞。

1.2.2 藥劑的配制選取青霉素、羅紅霉素、頭孢呋辛酯、恩諾沙星、慶大霉素5種藥劑處理。供試藥劑均分別設置4 000、2 000、1 000、500、250、100和50mg/L 7種濃度，用無菌水定容至250 mL。

取邊緣細胞培養(yǎng)液1 mL，分別加入以上藥劑一滴（ 1/20 mL）;以無菌水為對照，設2次重復，24 h后測定細菌含量，同時測定細胞的數(shù)量和活性。

1.2.3 邊緣細胞的數(shù)目 預備試驗發(fā)現(xiàn)，在豌豆種子根長為15 mm時，邊緣細胞數(shù)量最大。因而本試驗挑選15 mm長的根。每次均取根適量，剪取根尖3 mm，放人裝有1 000 μL無菌水的離心管中，10 000 r/min離心5 min，吸取上清液于另-1 000 μL離心管中，加無菌水稀釋備用。使用前搖均勻，使邊緣細胞及其黏液在水中充分展開再使用。用移液槍吸取10 μL含邊緣細胞的懸浮液于離心管中，再加入適量0.4%臺盼藍染色，充分混合后吸取2.5 μL的混合溶液在干凈的載玻片上劃線，并在電子顯微鏡下統(tǒng)計邊緣細胞數(shù)目，3次重復。

1.2.4 細菌抑制率和邊緣細胞降解率的計算

抑制率=（對照生長量一相應濃度生長量）/對照生長量xl00%

降解率=（處理前邊緣細胞總數(shù)一相應濃度處理后邊緣細胞數(shù)）/處理前邊緣細胞總數(shù)xl00%

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel、SAS有關軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度供試抗菌素對邊緣細胞的降解作用

由圖1可見，青霉素在50-4 000 mg/L的濃度梯度內對邊緣細胞的降解率為45.37%-75.31%，在50-1 000 mg/L的濃度范圍內降解率增加明顯，500 mg/L時降解率為63.89%，1 000 mg/L時降解率增加至73.15%，兩者之間差異較明顯。這說明500mg/L青霉素對于邊緣細胞的降解作用較緩慢，隨著濃度增高對于邊緣細胞的影響明顯增強。

由圖2可見，羅紅霉素在50-4 000 mg/L的濃度梯度內對于邊緣細胞的降解率為50.62%-77.47%，在50-1 000 mg/L的濃度范圍內降解率增加明顯，500 mg/L時降解率為58.95%，1 000 mg/L時降解率增加至68.21%，兩者之間差異較明顯。這說明500mg/L羅紅霉素對于邊緣細胞的降解作用較緩慢，隨著其濃度增高，對于邊緣細胞的影響明顯增強。

由圖3可知，頭孢呋辛酯在50-4 000 mg/L的濃度梯度內對邊緣細胞的降解率為43.52%-70.06%。在50-2 000 mg/L的濃度范圍內降解率增加明顯，1 000mg/L時降解率為60.80%，2 000mg/L時降解率增加至68.21%，兩者之間差異較明顯。這說明1 000mg/L頭孢呋辛酯對邊緣細胞的降解作用較緩慢，隨著其濃度增高，對邊緣細胞的影響明顯增強。

由圖4可知，慶大霉素在50-4 000mg/L的濃度梯度內對邊緣細胞的降解率為62.96%-90.74%。在50-2 000mg/L的濃度范圍內降解率增加明顯，1 000mg/L時降解率為73.15%，2 000 mg/L時降解率最高，達90.74%，兩者之間差異較明顯。這說明1 000 mg/L慶大霉素對邊緣細胞的降解作用較緩慢，隨著其濃度增高，對于邊緣細胞的影響明顯增強。

由圖5可知，恩諾沙星在50-4 000 mg/L的濃度梯度內對邊緣細胞的降解率為36.11% -81.48%。在50-1 000mg/L的濃度范圍內降解率增加明顯，500mg/L時降解率為66.98%，1 000 mg/L時降解率達72.22%，兩者之間差異較明顯，2 000 mg/L時降解率最高，達81.48%。這說明500 mg/L恩諾沙星對邊緣細胞的降解作用較緩慢，隨著其濃度增高，對于邊緣細胞的影響明顯增強。

2.2 不同濃度抗菌素對污染細菌的抑制作用

由表1可知，青霉素在50-4 000mg/L的濃度梯度內對邊緣細胞培養(yǎng)液污染細菌的抑制率為0-73.91%。在50-1 000mg/L時，青霉素抑制率增加幅度較大，在500、1 000和2 000mg/L時，其抑制率均達40%以上，分別為43.48%、45.65%和47.83%，在4 000mg/L時，抑制率增加到73.91%，說明青霉素使用濃度提高，對于污染細菌的抑制率有明顯的增強。

羅紅霉素在50-4 000mg/L的濃度梯度內對邊緣細胞培養(yǎng)液污染細菌的抑制率為17.39%-95.65%。在50-2 000mg/L時抑制率增加幅度較大，1 000mg/L時達67.39%.2 000 mg/L時抑制率達93.48%，兩者之間差異明顯，說明羅紅霉素在2 000 mg/L時，對于污染細菌的抑制作用有較明顯的增強。

頭孢呋辛酯在50-4 000mg/L的濃度梯度內對邊緣細胞培養(yǎng)液污染細菌的抑制率為34.78%-80.43%。在50-1 000mg/L時，抑制率增加幅度較大，50 mg/L時抑制率為34.78%，1 000mg/L時則為58.70%，兩者之間差異明顯，說明頭孢呋辛酯在1 000mg/L時對污染細菌的抑制作用有較明顯的增強。

慶大霉素在50-4 000mg/L的濃度梯度內對邊緣細胞培養(yǎng)液污染細菌的抑制率為84.78%-100%，各處理濃度抑制率均相對較高。

恩諾沙星在50-4 000mg/L的濃度梯度內對邊緣細胞培養(yǎng)液污染細菌的抑制率為76.09%-93.48%。在50-1 000mg/L時，抑制率增加幅度較大，500mg/L時抑制率為71.74%，1 000 mg/L時則為91.30%，兩者之間差異明顯，說明恩諾沙星在1 000mg/L時對污染細菌的抑制作用有較明顯的增強。

3 小結與討論

供試的5種抗菌素在50-4 000mg/L的濃度梯度內，對邊緣細胞均有一定程度的降解作用。其中，青霉素在50-1 000 mg/L的濃度范圍內降解率增加明顯，50 mg/L時降解率為45.37%，4 000 mg/L時降解率最大，為75.31%。羅紅霉素在50-1 000mg/L的濃度范圍內降解率增加明顯，500mg/L時降解率為58.95%，1 000mg/L時降解率達68.21%。頭孢呋辛酯在50-2 000mg/L的濃度范圍內降解率增加明顯，1 000mg/L時降解率為60.80%，2 000mg/L時降解率增加至68.21%。慶大霉素在50-2 000mg/L的濃度范圍內降解率增加明顯，1 000mg/L時降解率為73.15%，2 000 mg/L時解率增至最大，為90.74%。恩諾沙星在50-1 000mg/L的濃度范圍內降解率增加明顯，250mg/L時降解率為58.95%，500mg/L時降解率增加至66.98%，兩者之間差異較明顯。說明青霉素、羅紅霉素、頭孢呋辛酯、慶大霉素和恩諾分別在500、500、1 000、1 000和250mg/L時對邊緣細胞的降解作用較緩慢，隨著其濃度增高，對于邊緣細胞的影響會明顯增強。

5種抗菌素在50-4 000 mg/L的濃度梯度內對邊緣細胞培養(yǎng)液污染細菌均具有一定的抑制作用。其中，羅紅霉素在50-2 000mg/L時抑制率增加幅度較大，1 000mg/L時抑制率達67.39%，2 000 mg/L時達93.48%。頭孢呋辛酯在50-1 000mg/L時抑制率增加幅度較大，500 mg/L時抑制率為54.35%，1 000mg/L時則為58.70%。恩諾沙星在50-1 000mg/L時抑制率增加幅度較大，500mg/L時抑制率為71.74%，1 000 mg/L時則為91.30%，兩者之間差異明顯，說明羅紅霉素、頭孢呋辛酯和恩諾沙星對于污染細菌抑制率較適宜的選擇濃度分別為2 000、1 000和1 000 mg/L。青霉素和慶大霉素隨著使用濃度的提高，抑制率則明顯增強。

由于抗生素的大量頻繁使用，細菌抗藥性問題引起人們的關注。在抗生素的使用過程中誘導產(chǎn)生了具有忍耐性的抗性菌株，使得抗生素能殺死細菌的有效劑量在不斷提高。越來越多的試驗證明，環(huán)境致病菌耐藥性的增加和擴散將會對人類的公共健康構成潛在威脅。根邊緣細胞是從根冠表皮游離出聚集在根尖周圍的一群特殊細胞，發(fā)育受遺傳調控，在逆境中具有多種生物學功能。Hawes等[4]將這類細胞稱為根邊緣細胞，強調這類細胞位于根表面與土壤之間、有生物活性的生物邊界層。邊緣細胞于根冠產(chǎn)生后，發(fā)揮多方面的功能，如影響根際微生態(tài)系統(tǒng)、抑制病源菌侵入、減少根系的機械阻力、保護根尖等。表明抗菌素在抑制細菌的同時，也對正常的邊緣細胞有降解作用，被處理后的邊緣細胞總數(shù)均比處理前少。

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作者簡介：王芳（1964-），女，山東萊陽人，副教授，碩士，主要從事植物真菌病害研究，（電話）18689286491（電子信箱）1940480985@qq.com。