宋子文 劉煥臻 馬曉雨 孫國語 易嘉欣 張春華

尤遠祥2 王德秋3 李開隆1*

(1.東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040； 2.黑龍江省富錦縣林業(yè)局，富錦 156100； 3.吉林省臨江林業(yè)局，臨江 134600)

在重金屬污染的環(huán)境下，植物為減少其對自身生存造成的危害，通過增加細胞的滲透勢、功能蛋白的數(shù)量和增加抗氧化酶數(shù)量來維持細胞的正常代謝，從而提高植物的抗性[1]。近年來，對重金屬脅迫條件下的林木生長、葉綠素、生理生化特征的研究越來越深入[2]。葉綠素是一類與光合作用(photosynthesis)有關的最重要的色素。葉綠素含量的變化會影響植物光合作用，可能直接影響光合產(chǎn)物的形成和積累，影響植物生長發(fā)育和抵抗逆境的能力[3]。植物在高濃度重金屬情況下生長，細胞膜受到破壞，質膜通透性增強，細胞內(nèi)的物質外滲[4～5]，致使植物代謝功能紊亂甚至喪失代謝功能，植物通過增加脯氨酸等滲透調節(jié)物質來維持細胞的代謝提高自身的抗性[6]。多倍體細胞核內(nèi)染色體組加倍后，會帶來生長、生理變化，植物高度，抗逆性增強等特點[7]。多倍體的某些代謝產(chǎn)物比二倍體多，在生長條件一致下，9年生三倍體毛白楊的材積要比二倍體高2～3倍[8]；徐劍秋等[9]研究了干旱脅迫和鹽脅迫下，大青楊三倍體、四倍體葉綠素含量高于二倍體；周珊珊等[10]研究表明在低溫和高溫脅迫下，大花蕙蘭類原球莖三倍體、四倍體的MDA含量均顯著低于二倍體。三倍體或四倍體的日本黑松與二倍體相比含有較高的SOD可以明顯防止脂質過氧化物的形成和氧化損傷[11]。

大青楊(PopulusussuriensisKom.)是東北林區(qū)特有的鄉(xiāng)土速生樹種，也是恢復森林生態(tài)環(huán)境、營造生態(tài)林及短周期工業(yè)用材林最理想的樹種之一。目前對大青楊的研究主要集中在干旱脅迫[12]、低溫脅迫[13]、耐鹽分析[14]、轉基因表達譜分析[15]等方面。對大青楊多倍體在抗旱、抗鹽等方面有過研究[9]，而對于其在重金屬脅迫中的情況鮮有研究。本研究利用不同濃度的CdCl2處理大青楊多倍體扦插苗，對其在重金屬鎘脅迫下的生長、細胞膜透性、光合作用、抗氧化物酶、細胞的滲透調節(jié)物質等進行分析，以期探究大青楊多倍體對重金屬脅迫的生長及生理響應機制，為大青楊多倍體的選育和推廣種植奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大青楊三倍體和四倍體株系是東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室創(chuàng)制的，2019年5月中旬，在東北林業(yè)大學實驗基地塑料大棚，將1年生的大青楊不同倍體的穗條扦插育苗。每個營養(yǎng)杯中扦插一株，營養(yǎng)杯中的扦插基質配比為草炭土和沙子4∶1。扦插苗在相對濕度45%～65%、溫度(日/夜)26℃～32℃/20℃～25℃條件下培養(yǎng)，74 d后(8月4日)選擇長勢一致的幼苗進行后續(xù)試驗。

1.2 試驗方法

CdCl2濃度梯度為50、100、200、400 mg·L-1，每個處理設20次重復。CdCl2水溶液每3 d澆灌1次，以二倍體、三倍體、四倍體0 mg·L-1CdCl2為對照。在CdCl2脅迫處理4、7、10、13、16 d后，取樣測量生長、含水量、葉綠素丙二醛(MDA)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)。脅迫處理5、10、15 d后取樣測定葉片的葉綠素含量，每次取樣時間均為上午8：30～9：30，每個單株選取第3～5片功能葉，并設置3次生物學重復。取樣時避免機械損傷，將取下的葉片迅速放入液氮中速凍，保證葉片內(nèi)的物質沒有呼吸代謝，然后放在超低溫冰箱中待測。

丙二醛(MDA)測定采用硫代巴比妥氨酸法、超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光化還原法測定、過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定[16]、葉綠素含量測定采用丙酮和酒精混合法[6]，生長指標(苗高、地徑)的測定和葉片含水量的測定參照王學奎[17]的方法進行。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel進行數(shù)據(jù)的錄入，用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和多重比較(Duncan法)，用GraphPad Prism8軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度重金屬鎘對多倍體生長影響

由表1可知，大青楊3種倍體隨著脅迫濃度增加，樹高和地徑相對百分率下降趨勢，二倍體、三倍體、四倍體與0 mg·L-1相比，樹高和地徑在400 mg·L-1顯著下降(P<0.05)，樹高分別下降41.52%、19.42%、25.43%，地徑下降34.13%、34.19%、32.17%。隨著脅迫濃度的增加3種倍體的相對百分率均升高，相對百分率越高影響越大，所以影響順序：二倍體>四倍體>三倍體，從生長指標看，大青楊不同倍體扦插苗的苗高和地徑的生長對Cd的反應敏感，三倍體受脅迫影響較小，所以三倍體抗Cd脅迫能力最強。

表1 不同濃度重金屬鎘脅迫第13天時大青楊不同倍體生長比較

Table 1 Comparison of different ploidy growth ofP.ussuriensisunder different concentrations of heavy metal cadmium stress on the 13th day

系號Series處理Deal with(mg·L-1)株高Plant height(cm)相對百分率Relative percentage(%)地徑Ground diameter(mm)相對百分率Relative percentage(%)二倍體Diploid0.0144.14±12.12a0.08.32±0.12a0.0二倍體Diploid50138.37±4.58a4.07.51±0.45b9.7二倍體Diploid100116.61±5.13b19.17.17±0.49bc13.8二倍體Diploid200100.33±5.77c30.46.61±0.27c20.6二倍體Diploid40084.3±4.16d41.55.48±0.61d34.1三倍體Triploid0167.13±3.61a0.09.71±0.25a0.0三倍體Triploid50166.34±5.29a0.58.51±0.18b12.4三倍體Triploid100157.69±5.02b5.67.46±0.29c23.1三倍體Triploid200147.67±3.21c11.67.01±0.21c26.9三倍體Triploid400134.67±7.09d19.46.39±0.35d34.2四倍體Tetraploid086.67±3.12a0.06.87±0.11a0.0四倍體Tetraploid5079.33±7.02b8.46.42±0.31b6.1四倍體Tetraploid10077.33±1.53b10.85.95±0.19c13.4四倍體Tetraploid20073.33±2.08c15.45.62±0.16c18.2四倍體Tetraploid40064.63±2.01d25.44.66±0.31d32.2

注：相對百分率=(0 mg·L-1生長值-處理生長值)/0 mg·L-1生長值×100% 不同字母表示差異顯著性 下同

Note:Relative percentage=(0 mg·L-1growth value-treatment growth value)/0 mg·L-1growth value×100% Different letters in the table indicate significant difference among different drought stress conditions The same as below

圖1 不同濃度重金屬鎘脅迫第13天對大青楊不同倍體含水量影響 圖中不同字母表示差異顯著性 下同F(xiàn)ig.1 Effects of different concentrations of heavy metal cadmium on the 13 d on different ploidy water content of P.ussuriensis Different letters in the figure indicate significant difference among different drought stress conditionsThe same as below

2.2 不同濃度重金屬鎘脅迫對大青楊多倍體葉片含水量的影響

如圖1所示，Cd處理對大青楊3種倍體的水分代謝有顯著影響。隨著鎘濃度的增加，二倍體和四倍體的葉片含水量均呈下降趨勢，二倍體在0 mg·L-1時最高,200和400 mg·L-1時顯著下降，分別下降28.91%、34.1%(P<0.05)，其他的略微下降，三倍體呈先上升再下降的趨勢，三倍體在100 mg·L-1時顯著增長，比0 mg·L-1時增長13.12%(P<0.05)。四倍體在0 mg·L-1時最高，400 mg·L-1時顯著下降，下降了29.12%。

2.3 不同濃度重金屬鎘脅迫對大青楊多倍體葉綠素含量的影響

如圖2所示，隨著濃度的增加，二倍體、三倍體、四倍體均呈先上升后下降的趨勢，3種倍體的表現(xiàn)程度有所不同。二倍體隨濃度增加，100 mg·L-1時顯著上升(P<0.05)，比0 mg·L-1時增長了30.37%，三倍體在隨著濃度增加，葉綠素含量均比對照高，100 mg·L-1時葉綠素含量顯著增加(P<0.05)，比0 mg·L-1時增加43.86%，四倍體在100 mg·L-1時葉綠素含量顯著增加(P<0.05)，比0 mg·L-1時增加了41.92%。

圖2 不同濃度重金屬鎘脅迫第13天對大青楊不同倍體葉綠素含量影響Fig.2 Effects of heavy metal cadmium stress on different day 13 d on chlorophyll content in different ploidy of P.ussuriensis

圖3 不同濃度重金屬鎘第13天對大青楊不同倍體MDA含量影響Fig.3 Effects of different concentrations of heavy metal cadmium on the 13 d on MDA content in different ploidy of P.ussuriensis

圖4 不同濃度重金屬鎘第13天對大青楊不同倍體CAT活性影響Fig.4 Effect of heavy metal cadmium at different concentrations on day 13 d on the content of CAT activities in different ploidy of P.ussuriensis

圖5 不同濃度重金屬鎘第13天大青楊不同倍體SOD活性影響Fig.5 Effects of different concentrations of heavy metal cadmium on the 13 d on the SOD activities of different ploidy of P.ussuriensis

2.4 不同濃度重金屬鎘脅迫對大青楊多倍體葉片細胞膜透性的影響

如圖3所示，隨著脅迫濃度的增加，二倍體增加不顯著(P>0.05)；3種不同倍體的MDA的含量都是先增加后下降，隨著濃度的增加，三倍體在200 mg·L-1時顯著增加(P<0.05)，增加了40.87%，四倍體隨著濃度的增加，在200 mg·L-1時顯著增加(P<0.05)，增加了36.96%。說明三倍體的膜損傷最小，抗氧化能力最強，有較好的抗重金屬鎘的能力。

2.5 不同濃度重金屬鎘脅迫對大青楊多倍體葉片活性氧代謝的影響

如圖4所示，不同濃度重金屬鎘脅迫下，二倍體隨著濃度的增加酶活性有顯著的下降；在400 mg·L-1時顯著(P<0.05)，比0 mg·L-1時下降了56.89%，三倍體先上升后下降，在200 mg·L-1時顯著增加(P<0.05)，比0 mg·L-1時增加了41.44%，400 mg·L-1的時候顯著下降，下降了28.97%；四倍體先上升再下降，酶活性略微增加(P>0.05)，400 mg·L-1的時候抑制酶的活性顯著下降(P<0.05)，下降了36.19%，綜合來看三倍體有相對較好的抗性。

如圖5所示，隨著濃度的增加，二倍體先增加然后下降、增加再下降，在50、200、400 mg·L-1時顯著下降(P<0.05)，下降37.13%、39.27%、41.25%,100 mg·L-1時略微下降(P>0.05);三倍體先上升再下降，三倍體隨著濃度的增加，在100 mg·L-1時顯著增加，增長28.6%(P<0.05)；隨著濃度的增加，其他的略微增加；四倍體先下降然后上升再下降。在50 mg·L-1的時候下降顯著(P<0.05)，下降13.28%。說明三倍體和四倍體比二倍體的抗氧化系統(tǒng)更強。

3 討論

重金屬鎘脅迫影響了大青楊多倍體苗高和地徑的正常生長，隨著鎘濃度的增加，大青楊不同倍體的株高和地徑都顯著下降。王志香等人[18]在研究Cu、Zn、Pd、Cd 4種重金屬脅迫中發(fā)現(xiàn)，樟樹、大頭茶、紅鱗蒲桃的株高和地徑隨著重金屬濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢，與本研究結果相同，說明高濃度重金屬能抑制植物株高和地徑的生長。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫濃度的增加細胞膜的滲透性增加，對植株的傷害越來越大。二倍體和四倍體的含水量持續(xù)下降，而在三倍體中呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，重金屬對植物生長的抑制作用，可能是因為土壤中過量的重金屬與土壤組分發(fā)生一系列物理和化學反應，導致土壤性質發(fā)生變化。余東等[19]對枇杷的研究發(fā)現(xiàn)，高濃度鎘對枇杷根、莖、葉生物量和含水率均有顯著的抑制作用，這也與本研究結果相似。重金屬對植物的脅迫后，會影響細胞內(nèi)葉綠體的合成，使葉綠素含量下降，不利于植物的光合作用[20～21]。低濃度的重金屬會促進3種倍體葉綠素的合成，然而隨重金屬濃度的升高，超出植物的耐性與抗逆性，會造成植物葉綠素的降解，抑制其體內(nèi)葉綠素的合成[6]。盧揚章[22]的研究說明格木在鎘脅迫下，隨著鎘濃度的增加葉綠素的含量先增加后下降，與本研究結果相同。在正常生長條件下，植物體內(nèi)活性氧維持著合成與分解之間的動態(tài)平衡。在環(huán)境發(fā)生改變時，植物體內(nèi)活性氧代謝平衡遭到破壞，活性氧分子累積，造成植物體生理生化功能紊亂。為克服不良環(huán)境的影響，植物調整體內(nèi)抗氧化酶活性來清除活性氧物質，維持正常的生理狀態(tài)[23]。過氧化氫酶是植物中普遍存在的一種重要的氧化還原反應酶，酶活性的高低與抗逆性有著重要的關系，重金屬鎘脅迫下，植物細胞能利用抗氧化酶來調節(jié)氧化還原平衡，抗氧化系統(tǒng)越活躍則植物的抗性越強[24]。酶活性增加能增強植物在逆境下的抵抗力增強，所以酶活性可作為衡量植物抗性能力的指標之一[25]。萬文生等人研究了土沉香幼苗在Cd脅迫下，隨著Cd2+脅迫濃度的增加，其葉片中SOD出現(xiàn)不同程度的下降[25]。韋穎等人[26]研究了羅漢果在重金屬鎘脅迫下，隨著Cd濃度的升高，SOD活性逐漸升高，而后又降低。高濃度Cd脅迫加重了葉片氧化程度并對羅漢果生長產(chǎn)生一定的抑制作用，而SOD活性的提高與維持是羅漢果耐Cd脅迫的物質基礎之一。在本研究中，大青楊三倍體和四倍體的SOD活性均隨Cd脅迫濃度的增加先增加后下降，而二倍體隨著Cd濃度的增加而下降，與韋穎等人[26]的研究結果基本相同，說明鎘脅迫下在不同樹木中，抗氧化性有著類似的特性，顯示出抗氧化酶系統(tǒng)對重金屬脅迫產(chǎn)生了積極的響應?；钚匝跷镔|的增加破壞了細胞膜的透性，致使細胞內(nèi)的代謝紊亂，而植物體內(nèi)的抗氧化酶的增加能有效消除活性氧物質。過氧化氫酶(CAT)是抗氧化酶，催化過氧化氫產(chǎn)生氧氣和水，其活性與植物的抗逆性有一定的關系。CAT酶反映了植物生理生化代謝及生長發(fā)育的情況。CAT含量越高，植物的抗性越好。本研究中，總的來說二倍體中CAT含量隨著鎘脅迫濃度的增加而下降，而三倍體和四倍體均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。這表明低濃度CdCl2刺激雜草植物提高POD活性以清除活性氧自由基，但氧化脅迫加劇時，過多的活性氧物質不能及時消解，導致細胞質膜受損，抗氧化物酶系統(tǒng)紊亂。丙二醛(MDA)是由于生物體器官衰老或在逆境下受到傷害，其作為過氧化產(chǎn)物能與蛋白質、核酸、氨基酸等活性物質交聯(lián)，形成不溶性的化合物沉積，從而干擾細胞內(nèi)正常的生命活動與透性。韋穎等人[27]通過盆栽試驗，測定不同濃度Cd處理的羅漢果幼苗，MDA含量在相對低濃度Cd處理下MDA含量少于對照，隨著Cd濃度的升高指標有顯著升高，高濃度CdCl2脅迫加重了葉片氧化程度，并對羅漢果生長有一定的抑制作用。但本研究中3種倍體MDA含量隨著鎘濃度的增加均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。說明細胞MDA含量能反映出細胞的受傷害程度，重金屬脅迫作用下，大青楊二倍體、三倍體、四倍體生長指標增長趨勢相同，均是先增加后下降。低鎘濃度下促進葉綠素的形成，在100 mg·L-1時達到最高點。在高濃度下，三倍體的抗性遠高于其他兩種倍體，導致植物葉綠素含量降低,Cd2+重金屬離子對高等植物葉綠體的光合電子傳遞有抑制作用，直接干擾了葉綠素的生物合成，從而減少了植物對水分和養(yǎng)分的吸收,影響了植物正常的生長發(fā)育。細胞膜透性方面三倍體四倍含量均高于二倍體，處理后導致細胞質膜透性增加可能是由于與膜蛋白的結合或與磷酸酞胺乙醇胺和單分子層的磷脂絲氨酸反應，從而造成膜脂結構改變，致使MDA含量下降。活性氧代謝方面，隨著鎘濃度的增加，大青楊三倍體和四倍體的SOD值先增加后下降，二倍體處于下降趨勢?；钚匝跷镔|的增加越多，對細胞膜的透性破壞越嚴重，所以植物體內(nèi)產(chǎn)生更多的抗氧化酶來維持細胞的代謝。

總體來講，在重金屬鎘的5種濃度梯度脅迫下，大青楊多倍體幼苗在生長和生理生化方面有著顯著差異，綜合所有指標來看，在低濃度CdCl2的時候大青楊3種倍體有較好的耐受性，而在高濃度CdCl2脅迫下大青楊三倍體在含水量、葉綠素含量、CAT活性、MDA含量方面比四倍體分別高5.47%、25.47%、8.59%、28.47%，比二倍體分別高23.47%、44.63%、17.23%、31.48%，表現(xiàn)出較好的抗性。