山 丹 屈璐璐 李曉杰 馬一鳴 王俊杰

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，呼和浩特 010011)

草烏(蒙藥名泵阿)為毛茛科(Ranunculaceae)烏頭屬(Aconitum)多年生草本植物，又叫北烏頭(AconitumkusnezoffiiReichb.)[1]，是現(xiàn)階段開發(fā)利用的蒙藥材之一。蒙藥以干燥塊根及干燥葉入藥[2]，夏季葉茂盛花未開時采收，除去雜質(zhì)，及時干燥[3]。具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛之功效，味辛、苦、熱，有大毒[4]。草烏入藥的有效化學(xué)成分為烏頭堿(aconitine)、次烏頭堿(hypaeonitine)、新烏頭堿(mesaeonitine)、苯甲酰烏頭原堿(benzoylaconine)、苯甲酰新烏頭原堿(benzoylmesaconine)、苯甲酰次烏頭原堿(benzoylhypaconitine)等[5～7]，藥理研究證明草烏具有鎮(zhèn)痛、消炎、局部麻醉、抗腫瘤等作用[8]。草烏分布較廣，因產(chǎn)地、植被等環(huán)境因素，各地草烏藥用塊根及葉子的生物堿類含量差別較大[9]，所以用藥前測定或了解其生物堿含量對保障藥材使用安全具有重要意義。目前，草烏種子的應(yīng)用僅在植物繁殖方面[10～12]，用于藥用方面的研究甚少，對于草烏種子是否含有生物堿成分，是否具有開發(fā)利用價值，未見研究報道。本研究采用HPLC法[13～16]對不同產(chǎn)地草烏種子的生物堿含量進(jìn)行了測定與分析，為草烏種子的綜合利用提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(1525色譜泵，2428雙波長紫外檢測器，Breeze工作站)；超聲波清洗器(SB25-12DTDN型寧波新芝生物科技股份有限公司)；循環(huán)多用真空泵(SHB-3型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52型，上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

烏頭堿對照品(批號:302-27-2)、新烏頭堿對照品(批號:2752-64-9)、次烏頭堿對照品(批號:6900-87-4)、苯甲酰新烏頭原堿對照品(批號:63238-67-5)、苯甲酰次烏頭原堿對照品(批號:63238-66-4)(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院提供)。甲醇、三乙胺為色譜純，水為超純水，乙酸乙酯、異丙醇等試劑，其他為分析純。

草烏種子采集于內(nèi)蒙古地區(qū)(草烏的產(chǎn)地及采集時間見表1)。由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院王俊杰教授鑒定為蒙藥草烏。

表1 研究材料

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Supersil ODS2 5 μm(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1 mol·L-1，三乙胺(75∶25)；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：235 nm；柱溫：35℃。色譜圖詳見圖1～4。

圖1 1.苯甲酰新烏頭原堿；2.苯甲酰次烏頭原堿；3.新烏頭堿；4.烏頭堿；5.次烏頭堿對照品HPLCFig.1 1.Standards for HPLC reference of benzoyl neoaconitine; 2.Benzoyl hypoaconitine; 3.Neoaconitine; 4.Aconitine; 5.Hypoaconitine

圖2 草烏種子供試品HPLC圖(產(chǎn)地內(nèi)蒙古通遼市扎魯特旗) 1.苯甲酰新烏頭原堿；2.苯甲酰次烏頭原堿；3.新烏頭堿；4.烏頭堿；5.次烏頭堿Fig.2 HPLC chromatogram of alkaloids in A.kusnezoffii seeds(Zhalute of Tongliao City,Inner Mongolia) 1.Benzoyl neoaconitine; 2.Benzoyl hypoaconitine; 3.Neoaconitine; 4.Aconitine; 5.Hypoaconitine

圖3 草烏種子供試品HPLC圖(產(chǎn)地內(nèi)蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗) 1.苯甲酰新烏頭原堿；2.苯甲酰次烏頭原堿；3.新烏頭堿；4.烏頭堿；5.次烏頭堿Fig.3 HPLC chromatogram of alkaloids in A.kusnezoffii seeds(Alu Kerqin of Chifeng City,Inner Mongolia) 1.Benzoyl neoaconitine; 2.Benzoyl hypoaconitine; 3.Neoaconitine; 4.Aconitine; 5.Hypoaconitine

圖4 草烏種子供試品HPLC圖(產(chǎn)地內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗) 1.苯甲酰新烏頭原堿；2.苯甲酰次烏頭原堿；3.新烏頭堿；4.烏頭堿；5.次烏頭堿Fig.4 HPLC chromatogram of alkaloids in A.kusnezoffii seeds(Balin of Chifeng City,Inner Mongolia)1.Benzoyl neoaconitine; 2.Benzoyl hypoaconitine; 3.Neoaconitine; 4.Aconitine; 5.Hypoaconitine

2.2 對照品溶液制備

準(zhǔn)確稱取苯甲酰新烏頭原堿1.02 mg、苯甲酰次烏頭原堿1.15 mg、新烏頭堿0.98 mg、烏頭堿1.85 mg和次烏頭堿1.06 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.3 供試品溶液制備

精密稱取草烏種子樣品粉末(過40目篩)各1.0 g，置具塞錐形瓶中，用氨試液濕潤20 min，精密加乙酸乙酯和異丙醇混合溶液(1v∶1v∶1v)50 mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，用乙酸乙酯和異丙醇混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入10%鹽酸水3 mL，溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

表2 2種單酯型生物堿線型范圍考察結(jié)果

Table 2 The linear range investigation results for two types of monoester alkaloids

次數(shù)Number苯甲酰新烏頭原堿Benzoyl neoaconitine苯甲酰次烏頭原堿Benzoyl hypoaconitine進(jìn)樣量Injection amount(μg)峰面積Peak area進(jìn)樣量Injection amount(μg)峰面積Peak area10.204307520.233203420.408699980.464818830.6121051900.696406740.8161447210.928121451.0201847681.1510037961.2242196791.38115863

表3 3種雙酯型生物堿線型范圍考察結(jié)果

表4 加樣回收率結(jié)果

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取對照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，分別注入液相色譜儀，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：苯甲酰新烏頭原堿Y=186 061x-6 996.3，r=0.999 6，線性范圍0.204～1.224 μg；苯甲酰次烏頭原堿Y=16 939x+14 338，r=0.999 1，線性范圍0.230 0～1.380 0 μg；新烏頭堿Y=950 912x-17 973，r=0.999 6，線性范圍0.196 0～1.176 0 μg；烏頭堿Y=4E+06x-16 827，r=0.999 1，線性范圍0.037 0～0.222 0 μg；次烏頭堿Y=5E+06x-21 405，r=0.999 1，線性范圍0.021 2～0.127 2 μg由此可見，對照品進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系(表2～3)。

2.5 精密度試驗(yàn)

取供試樣品溶液10 μL，按2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定5種生物堿的峰面積積分比值計算RSD，結(jié)果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿RSD值均在1.4%～2.7%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.3項(xiàng)下供試品溶液，精密稱取10 μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測，分別于0，2，4，6，10，14，16，24 h依次進(jìn)樣測定。結(jié)果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿RSD值均在1.3%～3.1%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批草烏種子藥材，按2.3下方法制備成供試品溶液6份，精密吸取10 μL，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿RSD值均在0.88%～2.36%，表明特征圖譜的測定方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品粉末0.5 g，共6份，分別精密稱取相應(yīng)量的烏頭堿類標(biāo)準(zhǔn)品，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計算回收率(見表4)。

2.9 樣品測定

按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液3份，精密吸取10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件對內(nèi)蒙古通遼魯北、赤峰天山和賽罕烏拉草烏種子有效成分進(jìn)行含量測定(見表5)。

表5 3種不同產(chǎn)地草烏種子中烏頭堿類成分含量

Table 5 Content of alkaloids inA.kusnezoffiiseeds from three different habitats(mg·g-1)

產(chǎn)地Origin赤峰市阿魯科爾沁旗Alu Kerqin of Chifeng City赤峰市巴林右旗Balin of Chifeng City通遼市扎魯特旗Zhalute of Tongliao City苯甲酰新烏頭原堿Benzoyl neoaconitine8.22±0.06a7.64±0.06b7.85±0.06b苯甲酰次烏頭原堿Benzoyl hypoaconitine0.68±0.01b0.49±0.01c1.41±0.08a總烏頭原堿Total aconitine8.84±0.03a7.95±0.06b8.91±0.07a新烏頭堿Neoaconitine0.38±0.01b0.58±0.02a0.28±0.01c烏頭堿Aconitine0.72±0.01b1.09±0.06a0.66±0.01b次烏頭堿Aconitine reference0.49±0.01a0.15±0.01c0.25±0.01b總雙酯型生物堿Total diester alkaloids1.31±0.05b1.65±0.05a1.19±0.05b

3 討論

(1)邵財[17]等研究認(rèn)為，草烏藥材(塊根)中雙酯型生物堿的量明顯高于單酯型生物堿。本文研究結(jié)果顯示，在草烏種子中單酯型生物堿的量高于雙酯型生物堿，其中雙酯型烏頭堿含量為新烏頭堿0.296 2～0.596 1 mg·g-1、烏頭堿0.636 5～0.963 1 mg·g-1、次烏頭堿0.153 4～0.486 3 mg·g-1，單酯型烏頭堿含量為苯甲酰新烏頭原堿7.512 6～8.256 3 mg·.g-1、苯甲酰次烏頭原堿0.489 8～1.440 9 mg·g-1。這一結(jié)果表明，草烏種子與塊根中單酯型生物堿和雙酯型生物堿的含量變化規(guī)律相反。

(2)張艷[18]測定了不同產(chǎn)地的3批草烏塊根中生物堿的含量，結(jié)果表明，草烏中主要含有烏頭堿及苯甲酰烏頭堿，其他生物堿的含量極低，但未對不同產(chǎn)地材料烏頭堿含量變化規(guī)律進(jìn)行比較分析。本研究結(jié)果顯示，草烏種子與草烏藥材中的含量不一致。種子中主要含有苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭堿和烏頭堿，烏頭堿含量居中，次烏頭堿等含量最少。不同產(chǎn)地總烏頭堿含量和單體烏頭堿含量都存在差異?？倿躅^堿含量通遼市>赤峰市。單體烏頭堿含量的變化規(guī)律是苯甲酰新烏頭原堿含量依次為赤峰市阿魯科爾沁旗>通遼市扎魯特旗>赤峰市巴林右旗；苯甲酰次烏頭原堿含量為通遼市樣品的明顯高于赤峰市2個產(chǎn)地的樣品。次烏頭堿含量為變化赤峰市阿魯科爾沁旗>通遼市扎魯特旗>赤峰市巴林右旗的樣品。烏頭堿及新烏頭堿均為赤峰市2個產(chǎn)地的含量高于通遼市的樣品含量。

(3)隨志剛[19]等研究表明，在草烏藥材中使用流動相為甲醇-0.1 mol·L-1∶三乙胺(65∶35)配比條件的酸堿性適中，適用性強(qiáng)，峰形穩(wěn)定。本研究在草烏種子中使用此方法時，流動相跑機(jī)器時發(fā)生突然飄高，不穩(wěn)定的現(xiàn)象，對色譜峰造成干擾。為了克服這種現(xiàn)象，本研究對流動相的比例進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整為甲醇-0.1 mol·L-1∶三乙胺(75∶25)，調(diào)整后克服了基線飄高現(xiàn)象，且5種被測組分分離度較好，峰展寬適中，效果顯著[20]。表明測定草烏藥材和種子時的流動相比例不同；測定草烏種子時流動相甲醇比例調(diào)高，三乙胺比例調(diào)低為最佳。