劉佳欣 劉慧子 石晶靜 于 穎 王 超

(林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040)

已知植物莖的伸長生長受多種內(nèi)源激素的調(diào)控，如生長素吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid，BR)和乙烯(ethylene，ETH)等都促進(jìn)莖的伸長生長[9]。而外源激素的施加能夠改變內(nèi)源激素的含量，并影響莖生長發(fā)育。IAA、GA3和IBA浸種的兩兩交互作用對云南松胚軸和根長具有極顯著或顯著的差異影響[10]。外源激素GA3與ABA對烤煙莖尖處內(nèi)源激素GA、ABA、IAA含量以及株高、節(jié)間距伸長產(chǎn)生影響[11]。噴施外源激素GA3可調(diào)節(jié)矮稈基因型煙草莖尖中各內(nèi)源激素的含量，與正常株高基因型“K326”的各激素含量相接近，從而促進(jìn)莖生長[12]。從外界信號到性狀改變的過程是如何通過一系列的分子響應(yīng)完成的？哪些基因參與了其調(diào)控的分子途徑？分子機制如何？是研究激素調(diào)控植物生長發(fā)育的重要研究內(nèi)容之一。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄因子家族中最大的家族之一[1]，不僅在植物生長發(fā)育調(diào)控中調(diào)控生長發(fā)育的節(jié)奏以及器官的形成，而且可以響應(yīng)非生物脅迫誘導(dǎo)從而影響代謝產(chǎn)物的形成與激素信號傳導(dǎo)等[2～4]。轉(zhuǎn)錄因子的主要作用方式時通過與下游啟動子上的順式作用原件相結(jié)合的方式來調(diào)控靶細(xì)胞基因的表達(dá)從而形成同源、異源二聚體，也可與其他蛋白互作成為某種活化形式參與JA(jasmonate acid)、SA(salicylic acid)、ABA(abscisic acid)等信號傳導(dǎo)途徑,形成基因表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ABA誘導(dǎo)花青素合成部分依賴于MBW復(fù)合體中的核心轉(zhuǎn)錄因子,如TTG1、TT8及MYB75等[5]。水曲柳FmMYB5基因?qū)AA(indole-3-acetic acid)、ABA、GA3(gibberellin)、JA和SA 5種激素誘導(dǎo)都存在顯著響應(yīng)且都是正調(diào)控作用[6]。核桃JrEFM1可被ABA、JA、SA處理不同程度地誘導(dǎo)[7]。擬南芥AtMYB51受到水楊酸強烈誘導(dǎo)，AtMYB34則對茉莉酸甲酯最為敏感,處理后表達(dá)水平顯著提高[8]。這些研究說明植物MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與外源激素調(diào)控的植物發(fā)育中。種子萌發(fā)到下胚軸和胚根的形成是植物發(fā)育、形態(tài)建成的重要生物學(xué)過程，受到不同激素的調(diào)控，研究該過程響應(yīng)激素處理的MYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式，對研究木本植物發(fā)育及形態(tài)建成的分子調(diào)控具有一定的研究價值。

白樺(Betulaplatyphylla)是我國北方重要的經(jīng)濟和園林綠化樹種之一[13]，其具有材質(zhì)潔白細(xì)膩，抗旱耐瘠薄的優(yōu)良特性，適于做紙漿材，單板材和觀賞樹木。是研究林木重要性狀形成分子機制的良好材料，也是重要的改良樹種。本研究以白樺為材料，選擇MeJA(Methyl jasmonate)、ETH、ABA和KT對野生型白樺種子進(jìn)行噴灑處理，比較不同處理條件下白樺苗與對照苗胚軸及根發(fā)育情況；利用實時熒光定量PCR對經(jīng)過不同激素噴灑、NaCl和Mannitol處理下的白樺BpMYBs基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。分析其響應(yīng)激素處理的表達(dá)模式，為了進(jìn)一步明確BpMYB家族基因的信號調(diào)控及功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

將野生型白樺種子用流水沖泡2 d，然后種到人工營養(yǎng)土壤(腐殖質(zhì)∶蛭石∶珍珠巖3∶1∶1)中覆膜保持濕度(3 d后將膜揭掉)，放置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)，第二天開始進(jìn)行激素處理，分別用10 μmol·L-1的MeJA、100 μmol·L-1的ETH、20 μmol·L-1的ABA和50 μmol·L-1的KT對白樺種子進(jìn)行噴灑處理，同時以噴灑清水處理作為對照，期間每隔1 d噴灑1次。待白樺苗長到4周大小時，將不同激素處理后的白樺苗完整的從土壤中取出，用清水將根部的土壤洗凈，平鋪在干凈的玻璃平板上進(jìn)行觀察，并照相。用于基因表達(dá)分析的材料迅速用液氮處理，放于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｈ?周大小的白樺苗，分別由200 mmol·L-1NaCl和100 mmol·L-1Mannitol處理6、12、24和48 h，用水處理白樺苗作對照進(jìn)行基因表達(dá)分析。

1.2 RNA提取及cDNA合成

使用CTAB法提取白樺中的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)進(jìn)行一鏈cDNA的合成。反應(yīng)體系為20 μL:2×TS Reaction Mix10 μL，TransScript? RT/RI Enzyme Mix 1 μL，Anchored Oligo(dT)18 Primer(0.5 μg·μL-1) 1 μL，Total RNA 50 ng至5 μg，gDNA Remove 1 μL,補充RNase-Free Water至20 μL。反應(yīng)條件：在PCR儀(Biometra)中，42℃條件下，反應(yīng)30 min；85℃條件下，反應(yīng)5 s。實驗結(jié)束后，將cDNA于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因克隆及生物信息學(xué)分析

對白樺應(yīng)拉木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選鑒定出轉(zhuǎn)錄組中的BpMYB基因序列，利用NCBI的ORF finder程序進(jìn)行編碼區(qū)分析并鑒定其完整的CDS序列。以野生型白樺cDNA為模板，根據(jù)白樺MYB基因CDS序列設(shè)計特異引物(見附表1)進(jìn)行RT-PCR克隆?？寺‘a(chǎn)物送華大(北京)公司進(jìn)行測序。利用MEGA(V.6)對白樺MYB基因編碼的蛋白與擬南芥已知MYB蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.4 熒光定量RT-PCR分析

根據(jù)白樺MYB基因CDS序列，選取200 bp左右長度序列設(shè)計特異引物(見表1)進(jìn)行熒光定量PCR克隆。分別以不同脅迫處理和水對照的白樺苗cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR試驗，其中以Tubulin(GenBank number:FG067376)和Ubiquitin(GenBank number:FG065618)為內(nèi)參引物，設(shè)置3次重復(fù)(包括3次生物學(xué)重復(fù)以及3次技術(shù)重復(fù))。實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系20 μL，cDNA 2.0 μL，Primer F(10 μmol·L-1) 1.0 μL，Primer(10 μmol·L-1) 1.0 μL，SYBR Green Realtime PCR Master mix 10.0 μL，補充ddH2O至總體積20 μL。實時熒光定量PCR反應(yīng)程序：94℃ 30 s；94℃ 12 s，58℃ 15 s，72℃ 40 s，79℃讀板1 s，共45個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，運用ΔΔCt方法對基因的相對表達(dá)量進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析。

表1 BpMYB家族基因定量引物序列

圖1 不同激素處理的白樺幼苗表型分析 a.20 μmol·L-1 ABA；b.50 μmol·L-1 KT；c.100 μmol·L-1 ETH；d.10 μmol·L-1 MeJAFig.1 Phenotype of birch seedlings treated with different hormones a.20 μmol·L-1 ABA；b.50 μmol·L-1 KT；c.100 μmol·L-1 ETH；d.10 μmol·L-1 MeJA

2 結(jié)果與分析

2.1 激素處理下白樺表型觀察

對白樺種子分別用10 μmol·L-1的MeJA、100 μmol·L-1的ETH、20 μmol·L-1的ABA和50 μmol·L-1的KT進(jìn)行噴灑處理，4周后觀測其生長性狀。從苗的表型上來看(見圖1)，經(jīng)過ETH噴灑處理的白樺苗變化最為明顯，它的下胚軸比未處理的白樺下胚軸短，根長顯著減小，約是未處理白樺苗的20%；經(jīng)過ABA處理的白樺苗，下胚軸比未處理的白樺苗的下胚軸稍長，根長顯著增加，比未處理的根長30%；經(jīng)過KT處理的白樺苗的下胚軸和根均比未處理的白樺苗的下胚軸和根長；經(jīng)過茉莉酸處理的白樺苗下胚軸和根比對照稍長。

圖2 白樺MYB基因RT-PCR克隆Fig.2 RT-PCR cloning of birch MYB gene

2.2 白樺MYBs基因克隆及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過對所選白樺MYB基因進(jìn)行RT-PCR，成功擴增出11條目的片段，將這11條MYB目的片段利用膠回收試劑盒(Omega)進(jìn)行回收，用PMD18-T載體進(jìn)行連接并且成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從中隨機挑取陽性菌斑，利用11條MYB基因的特異性引物進(jìn)行菌液PCR，PCR結(jié)果顯示目的基因條帶正確(見圖2)，將菌液送至公司測序，測序結(jié)果與基因序列比對一致，成功克隆得到11條具有完整ORF的白樺MYB序列，這些基因編碼區(qū)堿基數(shù)在624～1 203 bp。根據(jù)克隆順序命名為BpMYB1、2、3、5、6、7、8、9、10、11和BpMYB12。本研究增加了一條研究前期克隆的BpMYB4，共12條。將這12條基因編碼的蛋白與107條擬南芥MYB家族基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示可以分為6大組，其中BpMYB1和BpMYB6聚為一組，BpMYB3、10、12聚為一組，BpMYB2、4、5和BpMYB8蛋白序列相似性最高，BpMYB7、9和BpMYB11進(jìn)化關(guān)系較近。BpMYB1與AtMYB61、AtMYB50進(jìn)化關(guān)系比較近，屬于R2R3類型的家族成員；BpMYB12與編碼葉軸MYB結(jié)構(gòu)域蛋白AtMYB91進(jìn)化關(guān)系比較近；BpMYB4l與AtMYB4進(jìn)化關(guān)系比較近；BpMYB5與種子萌發(fā)過程中的原花色素(proanthocyanidin)相關(guān)基因AtMYB123進(jìn)化關(guān)系比較近；BpMYB7與影響氣孔開關(guān)的AtMYB60進(jìn)化關(guān)系比較近；BpMYB11與AtMYB30進(jìn)化關(guān)系比較近；BpMYB9與AtMYB84進(jìn)化關(guān)系比較近(見圖3)。

2.3 白樺MYBs基因響應(yīng)激素處理的表達(dá)模式

以不同激素、NaCl和甘露醇處理白樺苗的cDNA為模板，以同期未經(jīng)處理的白樺苗為對照，利用實時熒光定量PCR技術(shù)對白樺中BpMYBs基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。

經(jīng)過20 μmol·L-1ABA的處理后，只有BpMYB4、8上調(diào)表達(dá)，但差異不顯著，其他BpMYB基因全都下調(diào)表達(dá)，除BpMYB11和BpMYB12下調(diào)表達(dá)差異非常顯著外，其他基因下調(diào)的倍數(shù)較茉莉酸和乙烯利處理下調(diào)的少。經(jīng)過50 μmol·L-1KT處理后，除了BpMYB11依然處于下調(diào)表達(dá)以外，其他的BpMYB基因全部呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)，其中BpMYB2、8上調(diào)倍數(shù)最高。經(jīng)過100 μmol·L-1ETH處理后，所有基因的表達(dá)模式出現(xiàn)較為明顯的統(tǒng)一趨勢，全部都呈現(xiàn)出下調(diào)表達(dá)，除了BpMYB2與BpMYB8下調(diào)表達(dá)量差異不顯著外，其他的BpMYB基因全都高度下調(diào)表達(dá)。其中BpMYB11的下調(diào)表達(dá)量差異最大。經(jīng)過10 μmol·L-1MeJA處理后， 除了BpMYB2和BpMYB8上調(diào)表達(dá)

圖3 白樺與擬南芥MYB蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析 擬南芥MYB家族蛋白序列來源于TAIR網(wǎng)Fig.3 Phylogenetic analysis of MYB protein in birch and Arabidopsis The protein sequence of MYB family in Arabidopsis is derived from TAIR website

圖4 激素處理下白樺MYBs基因的表達(dá)模式分析Fig.4 Analysis of expression pattern of MYBs gene in birch under hormone treatment

圖5 200 mmol·L-1 NaCl處理下白樺MYBs基因的表達(dá)模式分析Fig.5 Analysis of the expression pattern of MYBs genes in white birch under 200 mmol·L-1 NaCl treatment

圖6 100 mmol·L-1 Mannitol處理下白樺MYB基因的表達(dá)模式分析Fig.6 Analysis of the expression pattern of MYBs gene in birch under 100 mmol·L-1 mannitol treatment

外，其余基因全部為下調(diào)表達(dá)，其中BpMYB5和BpMYB12的下調(diào)表達(dá)量相對較少，其他基因都呈現(xiàn)出高度下調(diào)表達(dá)趨勢。

經(jīng)過高濃度NaCl脅迫處理后，BpMYB4基因最先響應(yīng)脅迫誘導(dǎo)。BpMYB9、10和BpMYB12表達(dá)差異不明顯。BpMYB11主要表現(xiàn)出顯著的下調(diào)表達(dá)模式，表達(dá)量最高可下調(diào)317倍。其他大部分基因表現(xiàn)出先下調(diào)后上調(diào)的表達(dá)模式，在48 h表達(dá)上升，包括BpMYB1、2、3、6和BpMYB7。BpMYB8主要在處理48 h被誘導(dǎo)。

在甘露醇脅迫處理6 h時，除了BpMYB3、6、8、11外其余基因均為上調(diào)表達(dá)，但表達(dá)量不高，最高的也僅僅為3.1倍；在甘露醇脅迫處理12 h的時候，只有BpMYB3輕度上調(diào)表達(dá)，其余MYB基因全部都呈下調(diào)表達(dá)模式，且為高度下調(diào)表達(dá)；在甘露醇脅迫處理24 h的時候，只有BpMYB11呈高度下調(diào)表達(dá)，雖然BpMYB1、2、9也呈下調(diào)表達(dá)，但表達(dá)差異較小，其余基因均為上調(diào)表達(dá)；經(jīng)過甘露醇脅迫處理48 h的時候，除了BpMYB4、8、10為上調(diào)表達(dá)外，其余基因均為下調(diào)表達(dá)，且為高度下調(diào)表達(dá)，但是，整體下調(diào)表達(dá)的強度比脅迫12 h的下調(diào)表達(dá)強度弱。BpMYB11在脅迫12 h后，都呈現(xiàn)出顯著的高度下調(diào)表達(dá)。

3 討論

在不同激素處理下，白樺4周幼苗表現(xiàn)出了不同的生長表型，ABA和KT處理，能夠促進(jìn)白樺幼苗下胚軸及根的伸長，而ETH處理，顯著抑制白樺幼苗下胚軸及根的伸長，但是促進(jìn)了下胚軸的增粗及側(cè)根的生長。MeJA處理效果不明顯。有研究表明高濃度(10-6～10-4mol·L-1)的ABA和MeJA均抑制花生根和下胚軸的生長；低濃度(10-7mol·L-1)的ABA作用不明顯，MeJA在低濃度下對生長表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)效應(yīng)[14]。高濃度(10 μmol·L-1)ABA做為脅迫因素在短時間內(nèi)對2種藜科抗逆植物的種子萌發(fā)和幼苗生長均有促進(jìn)效應(yīng)，而長時間作用則使2種植物產(chǎn)生不同的適應(yīng)策略，這種差異可能由于2種種子大小不同所導(dǎo)致[15]。較低溫度下(5、10℃)，植物材料的發(fā)芽率、根長、芽長均隨著ABA濃度的提高而降低，20℃時，1、5 mg·L-1的ABA處理對種子萌發(fā)均有促進(jìn)作用[16]。本研究10 μmol·L-1ABA和50 μmol·L-1KT處理對白樺下胚軸和根生長起到促進(jìn)作用，可能是因為白樺種子的特異性及早期短時間處理造成的。植物激素乙烯(ETH)調(diào)節(jié)植物生命周期許多方面，如種子萌發(fā)、根毛發(fā)育、根瘤形成、花衰老、凋謝和果實的成熟。ETH對胚軸伸長的作用依賴幼苗生長在光下或暗中，暗中ETH及ETH合成前體AC(C1-氨基環(huán)丙烷1-羧酸)抑制胚軸伸長[17]。本研究白樺種子播種于土壤中進(jìn)行ETH處理，起到了抑制胚軸伸長的作用。

從整體趨勢來看，本研究的白樺MYB基因在4種不同激素的處理下的表達(dá)模式的整體趨勢基本一致：在10 μmol·L-1MeJA、100 μmol·L-1ETH以及20 μmol·L-1ABA的噴灑處理后，基因大部分都處于下調(diào)表達(dá)，但是其表達(dá)量有所差異，其中在脫落酸處理下的下調(diào)表達(dá)量較其他兩個激素處理后的下調(diào)表達(dá)量低，而經(jīng)過乙烯處理后的差異表達(dá)量最高，呈高度下調(diào)表達(dá)模式，這種表達(dá)模式暗示了在ETH處理下，BpMYB基因的下調(diào)表達(dá)，在白樺幼苗下胚軸及根的生長抑制中起作用。在50 μmol·L-1KT的噴灑處理后，基因的表達(dá)量全部上調(diào)，說明白樺應(yīng)答KT誘導(dǎo)的BpMYBs基因呈現(xiàn)為正向的調(diào)控模式，有研究表明，過表達(dá)擬南芥MYBH基因能夠促進(jìn)擬南芥下胚軸的伸長[19～20]，本研究中這些上調(diào)的BpMYB基因可能在KT處理下白樺幼苗下胚軸及根的伸長中起作用。本研究BpMYBs基因?qū)τ诓煌庠醇に匦盘栱憫?yīng)不同，說明它們在不同激素信號途徑中起作用。其中有兩個表達(dá)模式較為特別的基因，一個是BpMYB2，在4種不同激素的處理下都處于一個上調(diào)表達(dá)的模式，但表達(dá)量有所差異，在激動素(KT)的處理下BpMYB2的表達(dá)量高度上調(diào)，可能與KT處理促進(jìn)下胚軸及根發(fā)育相關(guān)；BpMYB2與BpMYB8在激素處理下的表達(dá)模式相似，這可能與它們系統(tǒng)進(jìn)化分析聚為一組相關(guān)。另外一個基因是BpMYB11，它與BpMYB2正好相反，在4種不同激素的處理及鹽和旱脅迫處理下都處于一個下調(diào)表達(dá)的模式，而且均處于一個高度下調(diào)表達(dá)的趨勢，尤其是在100 μmol·L-1ETH噴灑處理后下調(diào)表達(dá)量極高，說明該基因受到外源激素信號的抑制。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆脅迫過程中根據(jù)是否依賴ABA信號途徑可將其分為依賴于ABA和獨立于ABA信號通路兩類[14]。本研究發(fā)現(xiàn)用20 μmol·L-1脫落酸(ABA)的噴灑處理后，BpMYB11、12表現(xiàn)為強烈的下調(diào)表達(dá)，說明這兩個基因可能依賴于ABA信號通路。在高濃度NaCl脅迫處理情況下，本研究大部分BpMYBs基因在脅迫處理初期下調(diào)表達(dá)，而在處理48 h被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；BpMYB4、5和BpMYB12在鹽和旱脅迫處理早期即被誘導(dǎo)，并持續(xù)上調(diào)表達(dá)，可能和之前的信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)[18]。總體上，系統(tǒng)進(jìn)化分析聚為一組的基因有著相似的表達(dá)模式。

附表1 BpMYB家族基因克隆的引物序列