闕嘉妤，龐曉霞，覃莉，李秀霞，施桂玲，王俊利

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住培基地技能培訓(xùn)中心，廣西 百色 533000)

人黃體生成素/人絨毛膜促性腺激素受體(LHCGR)基因?qū)儆贕蛋白偶聯(lián)受體家族，位于2號(hào)染色體的短臂上(2p21)，參與正常生殖過程的多個(gè)環(huán)節(jié)，主要在性腺上表達(dá)，包括女性卵巢卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、黃體和間質(zhì)細(xì)胞以及男性睪丸間質(zhì)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，尤其在激素調(diào)節(jié)、性分化、Leydig細(xì)胞發(fā)育中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)其與相關(guān)生殖疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]，。有研究表明，多囊卵巢綜合征(PCOS)[2]、 Leydig細(xì)胞發(fā)育不全(LCH)[3]、家族性男性性早熟(FMPP)[4]等生殖疾病與LHCGR多態(tài)性有關(guān)。本研究通過分析LHCGR基因多態(tài)性rs10495960和rs7579411兩位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在廣西地區(qū)人群中的分布，并與HapMap數(shù)據(jù)庫公布的4類人群(北京人群、日本人群、歐洲人群、非洲人群)的LHCGR 基因多態(tài)性分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，探討LHCGR基因多態(tài)性在不同地區(qū)人群中的分布差異，為深入研究LHCGR基因多態(tài)性與相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供重要的遺傳學(xué)理論依據(jù)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 研究對象 隨機(jī)選取2018年5月—2019年5月到右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心門診就診的健康體檢者573例，其中男274例，女299例，平均年齡(37.86±12.41)歲。所有研究對象相互之間無親緣關(guān)系，且都來自廣西地區(qū)，排除心腦血管疾病、感染性疾病及腫瘤患者等。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA 采集研究對象3 ml靜脈血，用乙二胺四乙酸二鉀( EDTAK2) 抗凝，樣本DNA 提取根據(jù)北京天根生化科技有限公司 DNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行，基因組 DNA 備用保存于-20℃冰箱。

1.2.2 制備引物 PCR引物交由上海天昊生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。rs10495960位點(diǎn)的上游引物序列為：GCCGTTCCTCCCTAGGTGCTAA；下游引物序列為：CCCTGTTCTTCTCGGATCCTTTG；延伸引物為：TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTTTTGGTCTCTGATTCTATTCCCGATGG；rs7579411位點(diǎn)上游引物序列為：CTCCAGTCTCCCCCTTGCTAAAGA；下游引物序列為：TGAGATCTGAGAGAGTATGAGGGGTGAA；延伸引物序列為：TCTCTCG

GGTCAATTCGTCCTT、AGATCTGAGAGAGTATGAGGGGTGATCG。

1.2.3 基因測序 反應(yīng)體系(10 μl)包含ddH2O 6 μl、純化后多重PCR產(chǎn)物2 μl、連接緩沖液 1 μl、5’連接引物混合液(1 μM)0.4 μl，3’連接引物混合液(2 μM)0.4 μl、高溫連接酶0.25 μl混勻。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 1 min，56℃ 4 min，38個(gè)循環(huán)，4℃保存?zhèn)溆?。?.5 μl稀釋后的連接產(chǎn)物，與0.5 μl Liz500 SIZE STANDARD，9 μl Hi-Di 混勻，上ABI3730XL測序前95℃變性5 min，用GeneMapper 4.1分析測序結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算廣西人群LHCGR基因2個(gè)位點(diǎn)的基因型和等位基因，用Hardy-Weinberg定律檢驗(yàn)研究對象是否有代表性。用χ2檢驗(yàn)比較不同組間的分布差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型檢測 LHCGR基因rs10495960和rs7579411位點(diǎn)經(jīng) Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，兩位點(diǎn)基因型P值(分別為0.10和0.87 )均>0.05，達(dá)Hardy-Weinberg平衡，表明本研究具有群體代表性。 測序結(jié)果顯示，在廣西地區(qū)人群中，rs10495960位點(diǎn)基因型為GG、GA、AA，rs7579411 位點(diǎn)基因型為CC、CT、TT。見圖1、圖2。

圖1 LHCGR基因rs10495960測序圖

圖2 LHCGR基因rs7579411測序圖

2.2 LHCGR基因rs10495960和rs7579411多態(tài)性在廣西地區(qū)人群中的分布 統(tǒng)計(jì)分析表明，廣西地區(qū)人群中，LHCGR基因rs10495960和rs7579411位點(diǎn)分別以GA/CT基因型多見，其頻率分別為46.07%和47.12%，以G和C等位基因分布頻率最高，各占64.05%和62.65%。rs10495960位點(diǎn)各基因型和等位基因頻率在男、女兩組間分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；rs7579411位點(diǎn)各基因型和等位基因頻率在男、女兩組間分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 廣西地區(qū)人群LHCGR基因rs10495960(G/A)和rs7579411(C/T)基因型及等位基因頻率分布

注：表內(nèi)計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)用[n(%)]表示。

2.3 LHCGR基因rs10495960和rs7579411位點(diǎn)多態(tài)性在不同地區(qū)種族人群間的比較 如表2所示，廣西地區(qū)人群 rs10495960位點(diǎn)的基因型頻率與HapMap-JPT、HapMap-CEU、HapMap-YRI 相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與 HapMap-CHB相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；廣西地區(qū)人群 rs10495960位點(diǎn)的等位基因頻率與HapMap-CHB、HapMap-JPT、 HapMap-CEU、HapMap-YRI相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

如表3所示，廣西地區(qū)人群rs7579411位點(diǎn)的基因型頻率與HapMap-JPT、HapMap-YRI相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與 HapMap-CHB、HapMap-CEU相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P>0.05)；rs7579411位點(diǎn)的等位基因頻率與HapMap-JPT、HapMap-YRI相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與 HapMap-CHB、HapMap-CEU相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 廣西地區(qū)人群 rs10495960位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率與HapMap公布的其他人群比較

注：①廣西人群：Guangxi，北京人群：HapMap-CHB，日本人群：HapMap-JPT，歐洲人群：HapMap-CEU，非洲人群：HapMap-YRI；②表內(nèi)計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)用[n(%)]表示。

表3 廣西地區(qū)人群rs7579411位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率與HapMap公布的其他人群比較

注：①廣西人群：Guangxi，北京人群：HapMap-CHB，日本人群：HapMap-JPT，歐洲人群：HapMap-CEU，非洲人群：HapMap-YRI；②表內(nèi)計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)用[n(%)]表示。

3討論

多囊卵巢綜合征(polysistic ovary syndrome，PCOS)是常見的婦科內(nèi)分泌疾病之一，最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，在我國婦女中，PCOS的患病率高達(dá)5.6%[5]。PCOS臨床主要表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)、無排卵性不孕、肥胖及高雄激素血癥，PCOS患者發(fā)生2型糖尿病、代謝綜合征、血脂異常、高血壓及子宮內(nèi)膜癌等疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加，嚴(yán)重危害著廣大女性的身心健康和生活質(zhì)量。

LHCGR基因?qū)に氐淖R(shí)別和結(jié)合起著重要作用，參與Leydig細(xì)胞發(fā)育、激素調(diào)節(jié)、性分化，在生殖內(nèi)分泌疾病的診斷和治療中具有重要意義。LHCGR基因在激素調(diào)節(jié)過程中是促排卵的關(guān)鍵，在PCOS患者的卵巢卵泡中被認(rèn)為是過早表達(dá)的。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，PCOS患者血漿中伴有LHCGR表達(dá)水平明顯升高，且LHCGR的高表達(dá)與胰島素抵抗相關(guān)。全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)提示LHCGR基因與漢族 PCOS發(fā)病相關(guān)[7]，Mutharasan等[8]檢測到歐洲血統(tǒng)婦女中PCOS 與LHCGR基因兩個(gè)位點(diǎn)rs7562215、rs 10495960多態(tài)性的強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)。在瑞典和丹麥患者中[9]，LHCGR基因中的兩個(gè)位點(diǎn)rs4597581和rs 4953617多態(tài)性與睪丸生殖細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。羅嘉莉等[10]用Meta分析發(fā)現(xiàn)LHCGR基因rs13405728多態(tài)性與PCOS的發(fā)生相關(guān)，但存在種族差異，在亞洲人種中rs13405728與PCOS的發(fā)病相關(guān)，在歐美人種中rs13405728與PCOS的發(fā)病無關(guān)聯(lián)。LHCGR基因多態(tài)性位點(diǎn)rs13405728的TC+CC基因型與新疆地區(qū)PCOS有相關(guān)性，可能是新疆地區(qū)PCOS的2個(gè)易感基因位點(diǎn)[11]。PCOS易感基因位點(diǎn)LHCGR在基因rsl3405728位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性參與了肥胖型維族PCOS患者的發(fā)病[12]。失活LHCGR基因突變可能是46，XY原發(fā)閉經(jīng)的常見原因[13]。Zielen AC等[14]發(fā)現(xiàn)在一個(gè)巴基斯坦家族中，LHCGR基因中的一個(gè)新的純合子框架移位變異與原發(fā)性卵巢功能不全有關(guān)。Lu Xuefeng等[15]的研究結(jié)果支持LHCGR的缺陷破壞排卵，但對受精和胚胎發(fā)育沒有影響。由此可見LHCGR基因多態(tài)性與生殖內(nèi)分泌疾病的研究較成熟廣泛，但目前未見報(bào)道LHCGR基因位點(diǎn)rs10495960和rs7579411 多態(tài)性在不同人群分布狀況。

經(jīng)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，廣西地區(qū)人群中LHCGR基因rs10495960 位點(diǎn)以G/A基因型較為常見(46.07%)，等位基因以G 較為常見(64.05%)；rs7579411位點(diǎn)則以C/T 基因型為主(47.12%)，等位基因以C為主(62.65%)。其中rs10495960位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率在男女中的分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示廣西地區(qū)人群中 rs10495960位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率與性別有關(guān)聯(lián)，男女之間存在分布的差異。另外，rs10495960位點(diǎn)基因型頻率、rs7579411位點(diǎn)基因型頻率及兩位點(diǎn)的等位基因頻率與 HapMap-JPT、HapMap-YRI人群比較，分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果表明，廣西人群中存在 LHCGR基因 rs10495960和rs7579411位點(diǎn)的多態(tài)性，這些多態(tài)性與其他種族之間存在差異性?；蚨鄳B(tài)性可因自然選擇、生活環(huán)境影響及種族不同等因素作用而存在很大差異，我們研究結(jié)果同樣體現(xiàn)這個(gè)特性?；蚨鄳B(tài)性可影響蛋白的表達(dá)和功能的差異，使得不同種群或個(gè)體之間對某些疾病的發(fā)生發(fā)展存在不同的易感性，這也是疾病藥物治療存在個(gè)體間差異和耐藥性的重要因素之一。因此，本研究有助于我們了解廣西人群中LHCGR基因多態(tài)性的遺傳背景，為今后深入研究PCOS與多態(tài)性關(guān)系提供數(shù)據(jù)支持。