馮俊麗 田小蘭 汪 藝

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310012）

志賀氏菌（Shigella）為一類(lèi)具有高度傳染性和危害嚴(yán)重的革蘭氏陰性桿菌， 也是人類(lèi)細(xì)菌性痢疾最為常見(jiàn)的病原菌，通常稱為痢疾桿菌[1]。 志賀氏菌常為食物爆發(fā)型或經(jīng)水傳播， 人類(lèi)對(duì)志賀氏菌普遍易感，每年全球有1.6 億人患病，約有110萬(wàn)人死亡， 絕大多數(shù)為5 歲以下兒童，10～100 CFU/mL 細(xì)菌即可致病[1-2]。 根據(jù)其抗原構(gòu)造不同，志賀氏菌可分為4 個(gè)主要類(lèi)群，即：痢疾志賀菌、福氏志賀菌、鮑氏志賀菌和宋內(nèi)氏志賀菌[3]。 在發(fā)展中國(guó)家， 由福氏志賀菌引起的感染性腹瀉疾病高居首位，而發(fā)達(dá)國(guó)家主要為宋內(nèi)氏志賀菌[3-4]。據(jù)報(bào)道， 歷史上多次志賀氏菌的爆發(fā)與外來(lái)人口的突然涌入有關(guān)[5-6]。 由于10～100 CFU/mL 細(xì)菌即可致病，在人群密集區(qū)，志賀氏菌引起的痢疾爆發(fā)和傳播速度很快并且難以控制[7]，亟需對(duì)志賀氏菌的快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確和特異性高的檢測(cè)方法。

我國(guó)自2005年開(kāi)始，在全國(guó)范圍內(nèi)開(kāi)展菌痢的監(jiān)測(cè)， 志賀氏菌的報(bào)告病例數(shù)一直高居全國(guó)法定傳染病的前5 位[1]。 目前，常用的志賀氏菌檢測(cè)方法為生化培養(yǎng)法，包含富集、分離、純化和鑒定等步驟， 通常需要將抽查樣品帶回實(shí)驗(yàn)室， 通過(guò)2～3 d 甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能完成整套檢測(cè)，既費(fèi)時(shí)費(fèi)力又較繁瑣[8]。 此外，志賀氏菌在人體外的存活力較差，只有小部分志賀氏菌可被檢測(cè)。為了克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限，PCR、熒光定量PCR 及分子雜交技術(shù)已應(yīng)用于志賀氏菌的檢測(cè)[9-12]。 這些分子診斷技術(shù)雖具有敏感性及特異性強(qiáng)、 可大批量檢測(cè)及避免主觀偏差等優(yōu)點(diǎn)， 部分解決了快速檢測(cè)的需求， 但由于試驗(yàn)過(guò)程需要專業(yè)技術(shù)人員及PCR基因擴(kuò)增儀、雜交儀等昂貴的儀器、設(shè)備而造成一定的局限性，在實(shí)際現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用中還存在許多困難，難以在基層或者貧困地區(qū)推廣[8]。建立簡(jiǎn)便、快捷、靈敏的可視化現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)十分必要。

近年來(lái)， 基于核酸適配體技術(shù)的病原細(xì)菌分子檢測(cè)方法逐漸出現(xiàn)，因其具有實(shí)時(shí)、快捷和可視化等優(yōu)點(diǎn)而引起人們廣泛關(guān)注[13-14]。核酸適配體是利用體外篩選SELEX 技術(shù)，從核酸分子文庫(kù)中得到單鏈寡核苷酸序列。 它能夠特異性地和靶物質(zhì)結(jié)合， 具有與單克隆抗體相媲美的親和力與特異性；與單抗相比核酸適配體還具有可體外篩選，靶分子范圍廣， 分子質(zhì)量較低， 沒(méi)有免疫源性和毒性，可通過(guò)化學(xué)合成制備、改造與標(biāo)記，化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[15]。 目前，已篩選獲得大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門(mén)氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、 單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和宋內(nèi)氏志賀菌（S. sonnei）等的核酸適配體[4，16-20]。 然而，對(duì)于我國(guó)流行的福氏志賀菌（Sligella flexneri）還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。本研究利用福氏志賀菌S. flexneri ATCC 12022的全菌，進(jìn)行SELEX 篩選，得到具有很高親和力和特異性的福氏志賀菌單鏈DNA 適配子。本研究結(jié)果為食品中致病微生物的快速檢測(cè)和鑒定提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

福氏志賀菌（ATCC 12022）、大腸桿菌（ATCC 25922）、沙門(mén)氏菌（ATCC 15611）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、單增李斯特菌（ATCC 19112）、宋內(nèi)氏志賀菌（S. sonnei ATCC 25931）、鮑氏志賀菌（S. boydii BNCC173713），購(gòu)于廣東省微生物研究所和北京北納生物公司；pMD18-T 載體、JM109 感受態(tài)細(xì)胞、 高保真PCR 酶PrimeSTARRHS DNA Polymerase、50 bp DNA Ladder、 瓊 脂糖，購(gòu)于大連寶生物工程（Takara）有限公司；PCR清潔試劑盒， 購(gòu)于杭州Axygen 生物技術(shù)有限公司；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 適配體文庫(kù)的構(gòu)建和引物合成

81 nt 的適配體隨機(jī)ssDNA 文庫(kù)5 -AGTATACGTATTACCTGCAGC-N40-CGATATCTCGGAGATCTTGC-3 由上海生工生物工程有限公司合成。 其兩端為固定序列，中間為40 個(gè)堿基的隨機(jī)序列。 同時(shí)合成文庫(kù)兩端的固定序列作為SELEX篩選過(guò)程中PCR 的上下游引物， 即FP：5′-AGTATACGTATTACCTGCAGC -3′ ；RP：5′ -GCAAGATCTCCGAGATATCG-3′。 適配體文庫(kù)和引物序列用TE 緩 沖液 （10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）稀釋到100 mol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 適配體篩選過(guò)程

基于whole-bacteria SELEX 技術(shù)的篩選過(guò)程主要參考郝聚敏等[21]的試驗(yàn)方法。 具體如下：取新鮮培養(yǎng)的福氏志賀菌菌液1 mL （108～109CFU/mL），3 500 r/min 離心5 min 收集菌體， 沉淀用結(jié)合緩沖液 （0.85% NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）洗滌1 次后，重新懸浮于100 μL 結(jié)合緩沖液中。 取適配體文庫(kù)30 μL （10 μmol/L），85 ℃變性5 min、冰浴10 min 后，加入到菌懸液中，30 ℃與菌體結(jié)合1 h。 結(jié)合反應(yīng)結(jié)束后，3 500 r/min 離心5 min 收集沉淀，隨后沉淀用結(jié)合緩沖液清洗2 次；然后在沉淀中加入100 μL TE 緩沖液， 并于85℃加熱5 min，冰浴10 min，使適配體序列與菌體分離。 最后經(jīng)15 000 r/min 離心10 min，收集含適配體序列的上清液。

以上述上清液為模板進(jìn)行不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2 μL 模板，10 μL 2 PrimeSTAR Max Premix （Takara），1 μL 上游引物（10 μmol/L），0.2 μL 下游引物（1 μmol/L），6.8 μL ddH2O。熱循環(huán)參數(shù)為： 98 ℃10 s，58 ℃10 s，72 ℃10 s，35 個(gè)循環(huán)。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，作為ss-DNA 文庫(kù)接著用于下一輪的SELEX 篩選。 為提高適配體篩選的特異性， 每2 輪正篩后進(jìn)行1 輪反篩， 即分別在第3，6，9，12，15，18 輪用大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、宋內(nèi)氏志賀菌和鮑氏志賀菌進(jìn)行反向篩選。 反篩過(guò)程與正篩基本相同，但在結(jié)合反應(yīng)結(jié)束后，離心收集不與反篩菌結(jié)合的上清液， 直接作為模板進(jìn)行隨后的不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增步驟。

1.4 適配體的測(cè)序分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬

以20 輪篩選得到的ssDNA 產(chǎn)物為模板，利用上下游引物進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR 清潔試劑盒（Axygen）純化后，與pMD18-T 載體相連。 連接反應(yīng)體系為：pMD18-T Vector（50 ng/μL）1.0 μL，PCR 產(chǎn)物 （約100 ng/μL）1.0 μL，Solution I 5.0 μL，ddH2O 3.0 μL； 反應(yīng)條件為16℃30 min。

將全部連接產(chǎn)物 （10 μL）加入至100 μL JM109 感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30 min。 42 ℃熱激45 s 后，再在冰中放置1 min。加入890 μL SOC培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)60 min。 取200 μL 菌液涂布于含X-Gal （20 mg/mL）、IPTG （200 mg/mL）、Amp（20 μg/mL）的LB-瓊脂平板培養(yǎng)基上，正面放置20 min 后，37 ℃倒置培養(yǎng)12～14 h。 挑選白色單菌落， 于1 mL 含Amp 的LB 液體培養(yǎng)基中（l.5 mL 離心管中）37 ℃搖床培養(yǎng)14 h。 取0.5 μL 菌液直接PCR 法確認(rèn)載體中插入片段的大小。 隨機(jī)挑選30 個(gè)陽(yáng)性克隆，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序獲得的序列及其結(jié)構(gòu)用DNAMAN 軟件進(jìn)行比對(duì)分析， 并利用在線程序Mfold （http：//mfold.rna.albany.edu/?q=mfold）進(jìn)行預(yù)測(cè)和模擬。

1.5 適配體的親和特異性考察

選擇并合成測(cè)序過(guò)程中出現(xiàn)頻率較高的適配子序列， 利用地高辛-抗地高辛抗體-過(guò)氧化物酶顯色反應(yīng)考察其與福氏志賀菌結(jié)合的特異性。 具體如下： 合成高頻適配體序列并對(duì)其5′端進(jìn)行地高辛標(biāo)記（上海生工）。然后按照正篩的操作步驟，取地高辛標(biāo)記的適配體序列10 pmol， 分別與1 mL 待測(cè)菌液（約108CFU/mL）結(jié)合1 h。 離心收集菌體并清洗2 次，沉淀中加入100 μL 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗地高辛抗體IgG∶HRP（1 ∶1 000），反應(yīng)10 min 后離心棄上清。 清洗沉淀3 次，加入100 μL TE 緩沖液重懸沉淀，并加入200 L 新配的顯色底物 （1 mg/mL TMB：底物緩沖液：30%H2O2=100 ∶900 ∶1）。 避光反應(yīng)10 min 后，加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)， 然后測(cè)得各個(gè)反應(yīng)管在450 nm 的吸光度值A(chǔ)450。 各個(gè)待測(cè)菌同時(shí)做一個(gè)不加適配體的空白對(duì)照。另外，各適配體設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組， 即不加菌液直接以各適配體（10 pmol）進(jìn)行地高辛-抗地高辛抗體-過(guò)氧化物酶顯色反應(yīng)。該試驗(yàn)共重復(fù)3 次，相對(duì)親和力=［A450（試驗(yàn)組平均值）-A450（對(duì)照組平均值）］/A450（陽(yáng)性對(duì)照組平均值）。

1.6 適配體親和常數(shù)考察

各適配體與福氏志賀菌的親和常數(shù)測(cè)定方法如下：將福氏志賀菌（約108CFU/L）分別于不同濃度的適配體序列 （10，50，100，150，200，250 nmol/L）結(jié)合1 h，然后按照1.5 節(jié)的方法計(jì)算不同濃度時(shí)的親和力，并以適配體濃度為橫坐標(biāo)，親和力為縱坐標(biāo)作圖。 通過(guò)Origin 8.0 軟件擬合每一條適配體的飽和結(jié)合曲線，并計(jì)算其解離常數(shù)Kd值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SELEX 篩選得到的適配子的克隆及序列分析

經(jīng)過(guò)14 輪正篩和6 輪反篩之后， 隨機(jī)挑選30 個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序分析。 測(cè)序結(jié)果顯示，共得到17 條序列（表1）。 其中有4 個(gè)適配子的序列（F1、F3、F9 和F16）在測(cè)序結(jié)果中出現(xiàn)2 次以上，是高頻適配子。

表1 SELEX 篩選得到的核酸適配體序列Table 1 Aptamer candidates obtained after SELEX selection

2.2 適配子的親和特異性驗(yàn)證

由于測(cè)序是隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行的， 因此在測(cè)序結(jié)果中高頻出現(xiàn)的適配子， 其在富集庫(kù)中所占的比率也可能較高。 本研究對(duì)選取出來(lái)的4 個(gè)高頻適配子進(jìn)行親和特異性分析。根據(jù)圖1 可知，這4 個(gè)高頻適配子對(duì)福氏志賀菌的親和力均顯著高于其它菌，呈現(xiàn)較好的親和特異性。 但比較而言，F(xiàn)-1 和F-9 對(duì)福氏志賀菌的親和力明顯較高，而且與宋內(nèi)氏志賀菌和鮑氏志賀菌的交叉反應(yīng)也更小。因此，后續(xù)只選F-1 和F-9 適配子進(jìn)行親和常數(shù)的測(cè)定。

圖1 適配體F-1, F-3, F-9 和F-16 與福氏志賀菌的親和力和親和特異性分析Fig.1 Analysis the affinities and binding specific of aptamer F-1, F-3, F-9 and F-16 to S. flexneri

2.3 適配子的親和常數(shù)及其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)F-1 和F-9 適配子進(jìn)行了親和常數(shù)的測(cè)定， 其中適配子F-1 的親和常數(shù)飽和曲線如圖2,擬合系數(shù)R2=0.979，呈較好的擬合效果，適配子與菌體之間的親和常數(shù)Kd=（51.3±3.25）nmol/L。適配子F-9 的飽和曲線與圖2 類(lèi)似，親和常數(shù)Kd=（42.6±7.11）nmol/L。 根據(jù)親和常數(shù)越小，適配體與靶標(biāo)的親和力越大的原則， 適配子F-9 對(duì)福氏志賀菌的親和力更大，這與圖1 的結(jié)果基本一致。

利用在線軟件DNA Mfold version 3.6， 適配子F-1 和F-9 的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3 所示， 兩者明顯不同，最小自由能（dG）分別為-7.39 kcal/mol和-6.98 kcal/mol， 該結(jié)果表明篩選得到的適配體結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。另外，從適配子F-1 和F-9 的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖中還可發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-9 的二級(jí)結(jié)構(gòu)明顯較F-1復(fù)雜，該特點(diǎn)可能與其較高的親和力有一定關(guān)系。

3 討論

圖2 適配體F-1 與福氏志賀菌結(jié)合的親和常數(shù)飽和曲線Fig.2 The binding saturation curve of aptamer F-1 to S. flexner

近年來(lái)， 分子生物學(xué)的發(fā)展為食品安全快速檢測(cè)提供了良好的技術(shù)平臺(tái)[22-23]。 然而，由于食品基質(zhì)成分復(fù)雜，基于PCR 和ELISA 的檢測(cè)方法常常會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果[24-25]。 而且，這些檢測(cè)技術(shù)需要在實(shí)驗(yàn)室中借助特殊的儀器來(lái)完成，不能滿足監(jiān)管部門(mén)同時(shí)對(duì)大批食品樣品快速、高通量的檢測(cè)需求[26]。 適配體技術(shù)無(wú)需對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行富集和培養(yǎng)，也無(wú)需裂解提取DNA，而且相比抗體適配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、 分子質(zhì)量更小，無(wú)需實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可通過(guò)人工合成大量制備[27]。因而， 在微生物的檢測(cè)鑒定中體現(xiàn)了較好的應(yīng)用前景。 本研究采用SELEX 技術(shù)首次篩選出了福氏志賀菌的適配子，親和特異性研究顯示，這些適配子不僅能用于區(qū)分福氏志賀菌與其它常見(jiàn)食源性致病菌如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌， 還可用于區(qū)分同屬的宋內(nèi)氏志賀菌和鮑氏志賀菌， 這為后續(xù)應(yīng)用適配子對(duì)福氏志賀菌進(jìn)行檢測(cè)鑒定奠定了較好的基礎(chǔ)。

圖3 適配體F-1 和F-9 的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Predicted secondary structure of aptamer F-1 and F-9

在致病菌的適配體篩選過(guò)程中， 一種是以菌體表面分子為靶標(biāo)進(jìn)行的。 這種篩選過(guò)程通常需要將細(xì)菌滅活，再分離純化出菌體表面的蛋白質(zhì)、多糖等大分子， 并以其作為靶標(biāo)進(jìn)行SELEX 篩選。但是，由于分離純化過(guò)程中可能改變了菌體表面大分子的空間構(gòu)型， 常常導(dǎo)致得到的適配體在實(shí)際致病菌的檢測(cè)過(guò)程中效率降低或完全不適用[28]。 本研究采用以福氏志賀菌全菌為靶標(biāo)，不僅簡(jiǎn)化了篩選過(guò)程， 還最大限度地保持菌體的自然狀態(tài)和表面分子的天然結(jié)構(gòu)， 有利于對(duì)實(shí)際食品樣品的檢測(cè)。

有文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為在不同條件下培養(yǎng)得到的細(xì)菌，其菌體狀態(tài)會(huì)存在差別[20]。 并且由于細(xì)胞壁及細(xì)胞莢膜的存在， 適配體很難直接與菌體表面的蛋白或多糖等大分子接觸[28]。 因此，全細(xì)胞的適配體篩選的確存在更多困難。 本研究嚴(yán)格控制不同批次福氏志賀菌的培養(yǎng)條件和時(shí)間， 并通過(guò)吸光光度計(jì)對(duì)活菌數(shù)目進(jìn)行定量， 光學(xué)顯微鏡檢測(cè)和表征其生長(zhǎng)狀態(tài)，盡量減少活菌靶標(biāo)的性狀差異，提高了檢測(cè)的重現(xiàn)性。

親和常數(shù)（Kd）是衡量適配體與其靶標(biāo)結(jié)合效率的主要指標(biāo)。親和常數(shù)越低，對(duì)靶標(biāo)的親和能力越高。 已有的研究顯示，大部分細(xì)胞、細(xì)菌等復(fù)雜大分子與適配子的親和常數(shù)都在nmol/L 數(shù)量級(jí)[29-30]。 本研究中，適配體F-1 和F-8 的Kd值分別為（51.3±3.25）nmol/L 和（62.6±7.11）nmol/L。 該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致， 表明其與靶標(biāo)的親和力較高。

目前， 食源性疾病已成為影響公共健康的重要因素。 嚴(yán)格的微生物檢驗(yàn)是保障食品安全的重要環(huán)節(jié)。 適配體對(duì)靶細(xì)胞可特異性識(shí)別且結(jié)合力很強(qiáng)，可與磁珠等結(jié)合抓取復(fù)雜基質(zhì)中的靶標(biāo)，并且作為一類(lèi)分子識(shí)別元件易于搭載各種傳感元件組建不同類(lèi)型的生物傳感器， 能滿足當(dāng)下對(duì)食品中可能存在的食源性致病菌的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求[13-14，26]。本研究初步篩選出來(lái)2 條針對(duì)福氏志賀菌全菌的適配體， 但該適配體與靶細(xì)胞特異性結(jié)合的分子機(jī)制尚未闡明。 在后續(xù)研究中我們將進(jìn)一步深入研究適配體與致病菌的親和作用機(jī)制， 結(jié)合高靈敏度的傳感器技術(shù)， 建立食品中福氏志賀菌的高效快速檢測(cè)方法。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)及相應(yīng)引物，以福氏志賀菌活菌細(xì)胞為靶標(biāo)，利用SELEX技術(shù)經(jīng)過(guò)20 輪篩選富集，得到了一組適配體序列進(jìn)行親和力和特異性考察。 最終， 適配體F-1 和F-9 表現(xiàn)出與福氏志賀菌較高的親和能力和親和特異性， 可進(jìn)一步應(yīng)用于檢測(cè)食品中的福氏志賀菌的檢測(cè)。 該研究結(jié)果為食源性致病菌快速檢測(cè)提供了新思路。