郭鳳茹 劉元雪 施文正 寧喜斌 李曉暉*（ 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海20306 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心 上海20306 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海）上海20306）

乳酸菌是一類能利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏染色陽(yáng)性的細(xì)菌。 目前報(bào)道的產(chǎn)乳酸細(xì)菌包括乳桿菌屬、片球菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬等43 個(gè)屬[1]。乳酸菌最早分離自酸牛乳中[2]，其后在發(fā)酵肉制品、乳制品、泡菜、發(fā)酵谷物等產(chǎn)品中得到廣泛的研究和利用[3-6]。 乳酸菌在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用主要有兩個(gè)方面：一是發(fā)酵微生物，在發(fā)酵制作乳制品、肉制品、泡菜的過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，另一方面是作為益生菌，定植于動(dòng)物腸道中，發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群，增強(qiáng)免疫，抑制腸道內(nèi)特異性病原菌的生長(zhǎng)繁殖及毒素的產(chǎn)生等益生功能[7-8]。乳酸菌作為魚類腸道的益生菌，在其養(yǎng)殖過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。 乳酸菌可以調(diào)節(jié)魚類腸道菌群平衡，提高飼料的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化率，加速魚類生長(zhǎng)。

隨著抗生素的廣泛使用， 越來(lái)越多的細(xì)菌出現(xiàn)耐藥性，且耐藥水平也不斷提高，抗生素耐藥性已經(jīng)成為一個(gè)全球化問(wèn)題[9]。 20 世紀(jì)80年代國(guó)外學(xué)者研究了乳酸菌的藥敏性[10-11]，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)抗生素有耐藥現(xiàn)象。長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外科研人員主要集中于臨床致病菌的耐藥性研究， 而對(duì)非致病菌和益生菌耐藥性的研究報(bào)道較少[12]。 乳酸菌作為一種益生菌，它的耐藥性有積極的意義。當(dāng)人或動(dòng)物服用抗生素時(shí)， 往往會(huì)把腸道中有益和有害的細(xì)菌同時(shí)殺滅，引起腹瀉，如果乳酸菌對(duì)抗生素有抗性，就可以緩解這種不良反應(yīng)，幫助宿主恢復(fù)腸道菌群平衡[13-14]。然而，有研究表明，在體外培養(yǎng)條件下耐藥基因能在不同種屬的乳酸菌菌株中發(fā)生轉(zhuǎn)移[15]。 這說(shuō)明對(duì)于進(jìn)入人體和動(dòng)物的外源性活菌在腸道內(nèi)生長(zhǎng)、定植、繁殖，其耐藥基因能以各種方式在腸道菌群間相互傳遞， 從而導(dǎo)致致病菌獲得耐藥性，危害宿主健康[16]。

本研究采用紙片擴(kuò)散法對(duì)分離自羅非魚腸道的乳酸菌對(duì)13 種抗生素（青霉素、氨芐西林、紅霉素、 卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、萬(wàn)古霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星）的藥敏性進(jìn)行檢測(cè)和分析，為分離得到的乳酸菌應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐及水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的合理使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供試菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存的分離自羅非魚腸道的乳酸菌，共42 株乳酸菌。 其中乳桿菌屬（Lactobacillus）32 株，乳球菌屬（Lactococcus）5 株，腸球菌屬（Enterococcus）5 株，菌株的分離鑒定結(jié)果可參考另一篇文章[17]。 如表1 所示，采用大腸桿菌（E. coli）ATCC 35218 和金黃色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 25923 作為質(zhì)控菌株。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 含實(shí)驗(yàn)抗生素的13 種藥敏紙片，分別為青霉素（Penicillin，PEN）、氨芐西林（Ampicillin，AMP）、 紅霉素（Erythromycin，ERY）、卡那霉素 （Kanamycin，KAN）、 鏈霉素（Streptomycin，STR）、慶大霉素（Gentamicin，GEN）、四環(huán)素（Tetracycline，TET）、 多西環(huán)素（Doxycycline，DOX）、 萬(wàn)古霉素 （Vancomycin，VAN）、 氯霉素（Chloramphenicol，CHL）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、 諾氟沙星 （Norfloxacin，NOR）、 氧氟沙星（Ofloxacin，OFL），購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司。紙片直徑為6 mm，符合抗生素紙片標(biāo)準(zhǔn)。 MRS 培養(yǎng)基、TPY 培養(yǎng)基、M17 培養(yǎng)基、TSA 培養(yǎng)基購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司。

表1 供試菌株16S rRNA 序列鑒定結(jié)果Table 1 Species identification of the test strains by 16S rRNA sequence analysis

1.2 方法

將乳桿菌屬、乳球菌屬和腸球菌屬供試菌株分別采用相應(yīng)的MRS、TPY、M17 液體培養(yǎng)基活化。 經(jīng)轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)，每隔1 h 取樣測(cè)定，使得到菌液的濃度為（3.0×108～8.0×108）CFU/mL。在9 cm 培養(yǎng)皿中分別倒入10 mL MRS、TPY、M17 瓊脂培養(yǎng)基， 取200 μL 活化菌液與5 mL 45 ℃0.6%的相應(yīng)軟瓊脂混勻 （此時(shí)菌液的濃度保持在1.5×107CFU/mL～3.0×107CFU/mL）， 將軟瓊脂均勻地鋪在預(yù)先制備好的同種固體培養(yǎng)基上， 于室溫下放置大約15 min，待上層瓊脂冷卻凝固后，將含有抗生素的藥敏紙片通過(guò)無(wú)菌操作貼放在瓊脂表面，每種藥敏紙片3 個(gè)平行，4 ℃擴(kuò)散3 h 后于37 ℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量產(chǎn)生的抑菌圈直徑，取3次測(cè)量的平均值作為結(jié)果。 質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC 35218 和金黃色葡萄球菌ATCC25923 的培養(yǎng)和保藏分別用營(yíng)養(yǎng)肉湯和TSB 培養(yǎng)基， 用與上相同的方法測(cè)定。 依照CHARTERIS W P[18]對(duì)乳桿菌和乳球菌[19]的抗生素藥敏標(biāo)準(zhǔn)（表2），判斷乳酸菌對(duì)常用抗生素的藥物敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控菌株對(duì)抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

質(zhì)控菌株大腸桿菌（ATCC 35218）和金黃色葡萄球菌（ATCC25923）的耐藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，抑菌圈直徑如表3 所示。 由圖1 可知，質(zhì)控菌株在藥敏紙片周圍形成清晰透明的抑菌圈，近乎圓形，可用于直徑的測(cè)量。 表3 的結(jié)果顯示，質(zhì)控菌株對(duì)實(shí)驗(yàn)抗生素的抑菌圈直徑均在允許范圍內(nèi)（敏感），說(shuō)明本試驗(yàn)方法可行，且藥敏紙片有效，可進(jìn)行乳酸菌對(duì)實(shí)驗(yàn)抗生素的藥物敏感性研究。

圖1 大腸桿菌對(duì)部分抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)Fig.1 The susceptibility experiment of E.coli to some antibiotics

表2 抗生素抗性的判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standards for judgment antibiotic resistance

表3 質(zhì)控菌株的耐藥性Table 3 Antibiotic resistance of reference strain

2.2 待測(cè)菌株對(duì)實(shí)驗(yàn)抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乳桿菌屬乳酸菌 由表4 可知， 兩種乳桿菌主要對(duì)KAN、GEN、VAN、CIP、NOR、OFL 表現(xiàn)出耐藥性，其中對(duì)KAN、VAN、CIP 和NOR 的耐藥性最強(qiáng)，高達(dá)80%以上；兩種乳桿菌均表現(xiàn)多重耐藥性，但對(duì)四環(huán)素類抗生素敏感。戊糖乳桿菌的3 株菌 對(duì)PEN、KAN、GEN、VAN、CIP、NOR的耐藥菌株數(shù)達(dá)100%，而這些抗生素均為養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用的抗生素種類，因此，這3 株菌有望應(yīng)用于魚類的生產(chǎn)，但其是否含有耐藥基因以及相關(guān)的轉(zhuǎn)座子，能否轉(zhuǎn)移給腸道其它菌群，進(jìn)而影響腸道健康，還需做基因的分型研究。植物乳桿菌的29 株菌對(duì)抗生素的耐藥性種內(nèi)差異較大，這可能和采樣時(shí)間、采樣時(shí)菌株所處環(huán)境、溫度和食性等有關(guān)；但50%以上的菌株為KAN-GEN-VAN-CIP-NOR-OFL多重耐藥，對(duì)抗生素敏感的菌株占比較小。

表4 乳桿菌屬乳酸菌對(duì)抗生素的抗性Table 4 Antibiotic resistant patterns of the Lactobacillus

2.2.2 乳球菌屬乳酸菌 由表5 可知， 棉籽糖乳球菌的藥敏性遺傳穩(wěn)定，5 株菌之間的藥敏性有一定的差異，其中對(duì)PEN（80%）和STR（60%）耐藥， 對(duì)其它抗生素較敏感， 對(duì)VAN、CIP、NOR 和OFL 的敏感性達(dá)100%。

表5 乳球菌屬乳酸菌對(duì)抗生素的抗性Table 5 Antibiotic resistant patterns of the Lactococcus

2.2.3 腸球菌屬乳酸菌 表6 表明腸球菌屬乳酸菌對(duì)實(shí)驗(yàn)抗生素的耐藥性種間差異明顯， 但對(duì)PEN、AMP、VAN、CIP、OFL 敏感，敏感菌株數(shù)分別達(dá)80%，100%，80%，80%和80%； 對(duì)ERY 中度敏感；而對(duì)其余抗生素則大多表現(xiàn)耐藥。意大利腸球菌的2 株菌對(duì)AMP、ERY、GEN 均耐藥，對(duì)TET 敏感，但對(duì)其余抗生素的藥敏性不同，但本試驗(yàn)僅分離2 株菌，其結(jié)果不具代表性，不能說(shuō)明意大利腸球菌對(duì)抗生素藥敏性的平均水平。 鉛黃腸球菌對(duì)PEN、AMP、CIP、VAN 和OFL 敏感（100%），對(duì)ERY中度敏感（100%），對(duì)其它抗生素耐藥，菌株耐藥性的差異可能來(lái)自于菌株本身生理特征和耐藥基因的差異。

表6 腸球菌屬乳酸菌對(duì)抗生素的抗性Table 6 Antibiotic resistant patterns of the Enterococcus

3 討論

本研究中， 菌株LPN05 對(duì)13 種抗生素都有抗性， 是耐藥普最廣的菌株， 其次是LPN04、LPN01 對(duì)11種抗生素都有抗性，LPN02、LPN03對(duì)10 種抗生素有抗性。 由表7 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，42株乳酸菌主要對(duì)PEN、KAN、GEN、VAN、CIP、NOR和OFL 耐藥， 耐藥菌株數(shù)分別為19 （45.2%），31（73.8%），24（57.1%），34（81.0%），30（71.4%），34（81.0%）和20（47.6%）。 羅非魚腸道乳酸菌對(duì)13種常見抗生素的藥物敏感性測(cè)試以及不同屬乳酸菌對(duì)抗生素的耐藥分析結(jié)果表明， 不同屬乳酸菌對(duì)抗生素的耐藥性表現(xiàn)出較明顯的種間差異，而相同屬的乳酸菌有其遺傳耐藥性， 也存在不同程度的種內(nèi)差異。 不同屬乳酸菌的耐藥譜呈現(xiàn)較大不同：乳球菌屬主要表現(xiàn)對(duì)氨基糖苷類的耐藥性；腸球菌屬對(duì)氨基糖肽類和氟喹諾酮類耐藥； 而乳桿菌屬對(duì)氨基糖苷類、糖肽類和氟喹諾酮類耐藥，對(duì)四環(huán)素類抗生素敏感。 乳酸桿菌對(duì)抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素敏感，如四環(huán)素類抗生素[20-21]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。而大多數(shù)乳酸桿菌對(duì)VAN 具有高水平的抗性[22]。Hamilton-Miller 等[23]報(bào)道了嗜酸乳桿菌和德氏乳桿菌對(duì)VAN 有天然抗性，與本試驗(yàn)乳桿菌對(duì)VAN 的耐藥性一致， 乳酸桿菌對(duì)VAN的抗性是由于它們?cè)陔木厶侵芯哂蠨-Al-D-Lactate 而不是D-Ala-DAla 二肽[24]。而Franz 等[25]發(fā)現(xiàn)分離自發(fā)酵乳中的腸球菌屬（主要是糞腸球菌和屎腸球菌）對(duì)VAN 敏感；而本試驗(yàn)中腸球菌屬對(duì)VAN 耐藥株為50%， 主要對(duì)AMP 敏感， 這與Lopes 等[26]的研究結(jié)果一致。 大多數(shù)乳球菌對(duì)氨基糖苷類抗生素具有抗性[27]，而本試驗(yàn)中乳球菌只對(duì)GEN 表現(xiàn)出了較高的耐藥性。 這表明，乳酸菌對(duì)抗生素的耐藥性可能和來(lái)源密切相關(guān)， 例如取樣環(huán)境、培養(yǎng)條件[28-29]等都會(huì)影響敏感性測(cè)定的結(jié)果。

表7 乳酸菌對(duì)13 種抗生素的抗性統(tǒng)計(jì)Table 7 Data of susceptibility to 13 kinds of antibiotics of lactic acid bacteria

本研究采用分離自羅非魚腸道的42 株乳酸菌（分別屬于5 個(gè)菌種）作為供試菌株，測(cè)試它們對(duì)13 種抗生素的藥敏性。 研究結(jié)果表明42 株乳酸菌都有一定的耐藥性，主要對(duì)PEN、KAN、GEN、VAN、CIP、NOR 和OFL 耐藥， 耐藥菌株數(shù)分別為19（45.2%），31（73.8%），24（57.1%），34（81.0%），30（71.4%），34（81.0%）和20（47.6%），菌株的耐藥性有一定的種間和種內(nèi)差異， 部分菌株有多重耐藥性。 本試驗(yàn)結(jié)果反映了羅非魚腸道乳酸菌的耐藥性情況， 為魚類腸道乳酸菌應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐以及水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的合理使用提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。