劉程程 王媛花 張?chǎng)╂? 儲(chǔ)西平 明亮

摘要：為了尋找優(yōu)質(zhì)高效的生物菌種資源，從森林土壤中分離出175個(gè)菌落特征相異的細(xì)菌，以草莓炭疽病病原菌為指示菌進(jìn)行平板對(duì)峙試驗(yàn)，篩選出一株拮抗效果最強(qiáng)的生防菌SKL108，抑菌率高達(dá)93.22%。經(jīng)16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和生理生化指標(biāo)結(jié)果分析，將該菌株鑒定為薩拉曼卡假單胞菌（Pseudomonas helmanticensis）。利用平板對(duì)峙培養(yǎng)法研究該菌株的抑菌譜，結(jié)果表明，菌株SKL108對(duì)多種病原真菌的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，包括常見的番茄灰葡萄孢菌、水稻立枯絲核菌、小麥禾谷鐮孢菌等。這一研究結(jié)果是薩拉曼卡假單胞菌作為生防菌在農(nóng)業(yè)上的首次報(bào)道，也表明該菌株具有開發(fā)成生物菌劑的潛力。

關(guān)鍵詞：拮抗菌;草莓炭疽病;篩選;薩拉曼卡假單胞菌（Pseudomonas helmanticensis）

中圖分類號(hào)： S432.1;S436.68+4 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）10-0125-05

收稿日期：2019-04-30

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金青年基金（編號(hào)：BK20160567）。

作者簡(jiǎn)介：劉程程（1987—），女，江蘇徐州人，碩士，助理研究員，主要從事生物農(nóng)藥的開發(fā)和應(yīng)用研究。Tel：（025）84390404;E-mail：626778317@qq.com。

通信作者：明 亮，副研究員，主要從事農(nóng)藥劑型的開發(fā)和應(yīng)用研究。Tel：（025）84390404;E-mail：johnbright1300@163.com。

在自然生態(tài)系統(tǒng)中，農(nóng)作物面臨多種病原菌的侵染威脅，近年來(lái)，農(nóng)作物種類和栽培方式多樣化，使得作物病害日趨嚴(yán)重。草莓因其口感和營(yíng)養(yǎng)，越來(lái)越受到消費(fèi)者的歡迎，但草莓病害大量發(fā)生，消費(fèi)者對(duì)草莓上農(nóng)藥殘留更加關(guān)注。近年來(lái)，隨著全國(guó)范圍內(nèi)設(shè)施草莓的種植面積不斷擴(kuò)大，空間密閉形成高溫高濕環(huán)境，使草莓炭疽病發(fā)生日益嚴(yán)重，造成草莓減產(chǎn)25%～30%[1]。草莓炭疽病在草莓整個(gè)生育期都能發(fā)生危害[2-3]，以苗期和移栽期最為嚴(yán)重，它是由草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae）、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioide）和尖孢炭疽菌（C. acutatum）等引起的，主要危害匍匐莖和根冠，造成根冠腐爛，最終導(dǎo)致植株萎蔫死亡，已嚴(yán)重制約了草莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[4-7]。目前國(guó)內(nèi)的防治措施正往生物防治方面發(fā)展，不僅因其環(huán)境友好、對(duì)人類健康安全，而且在防病的同時(shí)還能提高作物的品質(zhì)和產(chǎn)量[8-9]。關(guān)于草莓炭疽病的生物防治，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有少量報(bào)道，F(xiàn)reeman等利用4種木霉菌的提取物防治草莓、葡萄的炭疽病和灰霉病并取得了良好效果[10];張雪等的研究也證實(shí)了木霉菌劑能顯著提高紅顏草莓植株對(duì)炭疽病的抗病性[11];魏彩燕等鑒定出1株生防菌生防菌株MT-06對(duì)草莓炭疽病的生長(zhǎng)抑制率達(dá)71.75%[12]。但國(guó)內(nèi)的報(bào)道都尚在研究階段，暫時(shí)還未有產(chǎn)品登記。因此，對(duì)草莓炭疽病有拮抗效果的拮抗生防菌亟待開發(fā)。

本研究從南京紫金山森林土壤這一相對(duì)原始的生態(tài)環(huán)境中篩選出1株對(duì)草莓炭疽病菌有強(qiáng)烈的拮抗效果的生防菌SKL108，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、生理生化指標(biāo)結(jié)果分析以及16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，鑒定為薩拉曼卡假單胞菌（Pseudomonas helmanticensis），并利用平板對(duì)峙培養(yǎng)法研究了SKL108的抑菌譜。這為草莓炭疽病生物防治提供了優(yōu)良的菌種資源，更為假單胞菌屬作為拮抗菌開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試植物病原菌

草莓炭疽病菌、草莓灰霉?。˙otrytis cinerea）、葡萄潰瘍?。˙otryosphaeria rhodina）病原菌均由江蘇省丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

水稻紋枯?。≧hizoctonia solani）、水稻惡苗?。℅ibberella fujikuroi）、水稻稻曲?。║stilaginoidea oryzae）、小麥紋枯?。≧. cerealis）、小麥赤霉病（Fusarium graminearum）、小麥全蝕?。℅aeumannomyces graminis）、番茄灰霉?。˙. cinerea）病原菌均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

拮抗菌分離采用TSA培養(yǎng)基[13]：胰蛋白胨 15 g，大豆蛋白胨5 g，NaCl 30 g，瓊脂20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0～7.6。

拮抗菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

草莓炭疽病病原菌培養(yǎng)和平板對(duì)峙試驗(yàn)采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值自然。

1.3 生化試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、16S rRNA片段擴(kuò)增所用的各種酶、marker、dNTPs、buffer等試劑均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 拮抗菌的分離

在南京紫金山森林的0～20 cm土層中隨機(jī)選取土壤樣品20份，自然晾干，稱取土壤樣品 10 g/份，混合均勻，稱取混合土樣10 g，倒入三角瓶中，用無(wú)菌水定容至100 mL，加入適量滅菌的玻璃珠，置于水平搖床（太倉(cāng)華美生化儀器廠，THZ-E）160 r/min 振蕩30 min混勻，制成1×10-1 g/mL土壤懸浮液，依次加無(wú)菌水稀釋制成10-2～10-5 g/mL濃度梯度的系列土壤懸浮液，取各稀釋液100 μL涂布于TSA固體培養(yǎng)基上，于30 ℃、12 h下光照培養(yǎng)，2 d后根據(jù)菌落特征挑選出單個(gè)菌落，劃線純化3次，純化后的細(xì)菌菌株置于LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min下培養(yǎng)過夜后4 ℃冰箱保存。

1.5 拮抗菌的篩選

草莓炭疽病菌拮抗細(xì)菌初篩和復(fù)篩采用對(duì)峙生長(zhǎng)法。將各細(xì)菌在LB固體培養(yǎng)基上活化，然后分別移入2 mL LB培養(yǎng)液中，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，獲得拮抗菌液。將草莓炭疽病菌在PDA固體培養(yǎng)基上活化，沿菌落邊緣用直徑5 mm打孔器打孔，將菌餅置于空白PDA平板中央。培養(yǎng)皿四周呈“十”字形點(diǎn)接拮抗菌液（距培養(yǎng)皿中心 25 mm），每個(gè)處理重復(fù)3皿，設(shè)清水對(duì)照。28 ℃恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照平板菌落長(zhǎng)滿時(shí)測(cè)量拮抗帶寬，并計(jì)算抑菌率[14]。

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.6 拮抗菌的鑒定

1.6.1 拮抗菌DNA的提取 將對(duì)峙篩選的拮抗菌在LB固體培養(yǎng)基上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單菌落，28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)過夜，離心培養(yǎng)的菌液，收集菌體，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌DNA，-20 ℃保存。

1.6.2 16S rRNA基因擴(kuò)增 將提取好的拮抗細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，所用引物為16S rRNA通用引物（27F，5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;1492R，5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR反應(yīng)采用25 μL體系：10×buffer濃縮反應(yīng)緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTP混合物2 μL，MgCl2 2.5 μL，rTaq 0.25 μL，上游引物1 μL，下游引物 1 μL，模板1 μL，無(wú)菌水補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性3 min;95 ℃ 變性1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，切膠回收后，送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序得到的堿基序列在GenBank中進(jìn)行同源序列分析，并用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6.3 拮抗菌的生理生化分析 根據(jù)16S rRNA初步鑒定的菌株種類，參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》選擇所需測(cè)定的生理生化項(xiàng)目，測(cè)定菌株的生理生化反應(yīng)。

1.7 菌株SKL108抗菌譜測(cè)定

采用對(duì)峙生長(zhǎng)法測(cè)定SKL108對(duì)9種植物病原真菌的抑制作用。將各病原菌在PDA固體培養(yǎng)基上活化，試驗(yàn)方法同“1.5”節(jié)，計(jì)算SKL108對(duì)各病原菌的抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離和篩選

本研究從土樣中共分離到175個(gè)菌落特征相異的細(xì)菌，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定各細(xì)菌對(duì)草莓炭疽病病原菌的抑制作用。其中有3個(gè)表現(xiàn)為拮抗作用（圖1），將選出的3個(gè)拮抗菌株進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)1個(gè)菌株編號(hào)為SKL108的生防菌拮抗效果顯著高于另外2個(gè)菌株（P<0.05），抑菌率高達(dá)93.22%（圖2）。

2.2 菌株SKL108的鑒定

菌株SKL108的細(xì)胞形態(tài)和生理生化指標(biāo)結(jié)果見表1。提取分離出的拮抗菌株SKL108的基因組DNA，用通用引物進(jìn)行16S rRNA的PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)得到約1 400 bp長(zhǎng)度的片段。將這段序列在GenBank中進(jìn)行Blast分析，與已有的序列進(jìn)行同源性比較，并用ClustalX軟件進(jìn)行多重序列比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株SKL108與薩拉曼卡假單胞菌（Pseudomonas helmanticensis） OHA11（HG940537）的

親緣關(guān)系最近，相似度達(dá) 99.3%，用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將菌株SKL108鑒定為薩拉曼卡假單胞菌。

2.3 菌株SKL108對(duì)10種植物病原真菌的抑制作用

由表2和圖4可見，菌株SKL108對(duì)10種供試植物病原真菌均有較強(qiáng)的拮抗作用，其中對(duì)水稻惡苗病菌的抑制率最低，為47.2%，對(duì)番茄灰霉病菌抑制效果最高，達(dá)93.9%，說明其對(duì)大部分的病原真菌都有較好的抑制作用，具有較廣的抗菌活性。

3 討論與結(jié)論

草莓炭疽病的防治主要遵循以預(yù)防為主、綜合防治的方法。選育抗病品種防控草莓炭疽病固然是最經(jīng)濟(jì)有效的途徑，但由于炭疽病的抗性機(jī)理復(fù)雜，導(dǎo)致抗性品種資源缺乏。在大部分地區(qū)，種植戶還是依靠藥劑進(jìn)行病害防控，但化學(xué)農(nóng)藥會(huì)導(dǎo)致炭疽病菌抗藥性不斷增加，防治效果越來(lái)越不理想。韓國(guó)興等曾報(bào)道，多年連續(xù)使用多菌靈和乙霉威防治草莓炭疽病，導(dǎo)致高抗菌株的比例達(dá)90%以上，單劑和兩者的混劑都不宜再推廣應(yīng)用[15]。鑒于化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致的抗性和殘留問題在草莓產(chǎn)業(yè)中越來(lái)越受到重視，利用拮抗生防菌防治草莓炭疽病成為一種極具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐未胧16]。

假單胞菌屬是土壤中分布最廣的微生物類群之一，也是一種重要的植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）。Haas等證實(shí)植物根際假單胞菌應(yīng)用在谷物種子或土壤中可以抑制病原菌的生長(zhǎng)[17]，其作用機(jī)理主要包括根際營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、分泌降解微生物的酶及抗生作用等。據(jù)

報(bào)道，假單胞菌可以產(chǎn)生多種抗生素如2，4-二乙?；g苯三酚、吩嗪酸、硝吡咯菌素、根菌素、假單胞菌酸等，能大大減輕病原菌對(duì)植物的侵染[18]。目前假單胞菌在生物防治領(lǐng)域研究最為深入的是熒光假單胞菌（P. fluorescens），它產(chǎn)生的噬鐵素能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的同時(shí)抑制植物病害的發(fā)生。除噬鐵素外，它還能夠產(chǎn)生十幾種抗生性次級(jí)代謝產(chǎn)物，在生防菌劑的開發(fā)及應(yīng)用方面具有巨大的潛力[19-20]。

本研究從相對(duì)原始的森林土壤中分離篩選出1株對(duì)草莓膠孢炭疽菌有強(qiáng)烈抑制效果的拮抗生防菌SKL108菌株，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)觀察、生理生化測(cè)定及16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹分析等，鑒定該菌株為假單胞菌屬，與熒光假單胞菌有很高的親緣關(guān)系。菌株SKL108發(fā)酵液對(duì)草莓炭疽病的抑制率高達(dá) 93.2%，且抑菌譜較廣。這一研究結(jié)果為開發(fā)高效安全的生防菌劑拓寬了研究方向，也提供了優(yōu)質(zhì)的菌種資源。盡管室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)中菌株SKL108抑菌作用效果明顯，但還須要進(jìn)行大量的實(shí)踐工作才能明確抑菌作用機(jī)理和田間試驗(yàn)防治效果。因此，下一步的研究重點(diǎn)是初步篩選菌株SKL108的初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物，同時(shí)明確田間防效，以期開發(fā)出優(yōu)質(zhì)高效的生物菌劑。

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