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        利用響應(yīng)面法優(yōu)化全蝕病生防菌YB—81的發(fā)酵條件

        2015-05-06 15:29:49全鑫等
        天津農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年9期
        關(guān)鍵詞:生防菌發(fā)酵響應(yīng)面法

        全鑫等

        摘 要:為了優(yōu)化全蝕病生防菌株YB-81的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件,提高其對(duì)全蝕病的抑制效果,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法(Response surface methodology)對(duì)小麥全蝕病生防菌株YB-81的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。生防菌株YB-81的最優(yōu)發(fā)酵條件為:時(shí)間36 h,溫度36 ℃,初始pH值8.0,轉(zhuǎn)速200 r·min-1,牛肉膏+葡萄糖(1∶1)0.53%,蛋白胨0.99%,氯化鈉0.20%。在此培養(yǎng)條件下試驗(yàn),其菌落總數(shù)為18.8億個(gè)·mL-1,較基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了72%,對(duì)全蝕病菌抑制率達(dá)到87.2%,較優(yōu)化前提高了32.5%。生防菌 YB-81的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件的確定, 可為該菌大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

        關(guān)鍵詞:小麥全蝕?。簧谰?;響應(yīng)面法;發(fā)酵

        中圖分類號(hào): S476.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A DOI 編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2014.09.013

        Abstract: In order to raising the antagonistic effect, the growth conditions and culture medium of biocontrol strain YB-81 was optimized based on single factor test. The optimal culture conditions of the biocontrol strain YB-81 were determined for 0.53% beef extract+glucose(1∶1), 0.99% peptone, 0.20% odium chloride, temperature at 36 ℃, pH 8.0, speeding at 200 r·min-1, the incubation time of 36 h. The total numbers of colony was 1.88×109·mL-1, improving by 72%, and the inhibition rate to Gaeumannomyces gramims was 87.2%, improving by 32.5% with the optimal growth conditions. The optimal growth condition of the biocontrol strain YB-81 was identified, providing a theoretical basis for enlargement of production.

        Key words: wheat take-all;biocontrol strain;response surface methodology;fermentation

        小麥全蝕?。╓heat take-all)是一種典型的根部土傳病害,由子囊菌亞門的禾頂囊殼菌小麥變種(Gaeumannomyces gramims var. tritici)侵染所致[1-4]。小麥發(fā)病后,植株根部變黑,分蘗減少,成穗率降低,千粒質(zhì)量下降,甚至全株枯死,減產(chǎn)幅度很大,民間稱此病害為“小麥癌癥”。最近5年,小麥全蝕病擴(kuò)展迅速,造成嚴(yán)重危害, 且防控困難已經(jīng)成為一種非常頑固的土傳病害。目前,對(duì)全蝕病的防治依靠化學(xué)藥劑拌種,常規(guī)藥劑防治效果不好,全蝕凈防效較好但成本太高。

        YB-81菌株是河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所利用現(xiàn)代微生物篩選和分子生物學(xué)技術(shù)培育出的對(duì)小麥全蝕病具有高效抑制作用的枯草芽孢桿菌,通過室內(nèi)生測試驗(yàn)以及田間試驗(yàn)證明對(duì)小麥全蝕病菌有較好的防治作用,目前該菌株專利已授權(quán)(專利號(hào)2010101 99739.1)。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化了該菌株的發(fā)酵條件,目的是為提高該菌株的防病效果,進(jìn)一步中試生產(chǎn),為應(yīng)用于大田提供理論基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 材 料

        供試菌株及培養(yǎng)基:枯草芽孢桿菌YB-81和小麥全蝕病菌(Gaeumannomyces gramims var. tritici)均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供?;A(chǔ)培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基,小麥全蝕病菌培養(yǎng)基為PDA。

        1.2 方 法

        1.2.1 生長量的測定 采用平板菌落計(jì)數(shù)法[5]。各處理培養(yǎng)液用梯度稀釋法稀釋涂板后,37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)36~48 h,調(diào)查平板菌落數(shù),然后計(jì)算活菌數(shù)(cfu·mL-1)。

        1.2.2 抑菌率測定 抑菌率的測定采用含毒介質(zhì)法[6]。

        1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化 通過單因素試驗(yàn),測定不同時(shí)間、溫度、初始pH值、藥瓶轉(zhuǎn)速對(duì)YB-81菌株發(fā)酵效果的影響。

        1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基試驗(yàn)設(shè)計(jì),選取對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基有顯著影響的3個(gè)因素即碳源、氮源及無機(jī)離子,采用單因素試驗(yàn)方法確定3個(gè)因素的試驗(yàn)點(diǎn),每個(gè)因素選擇2個(gè)水平,測定各發(fā)酵培養(yǎng)基中芽孢桿菌的生長量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,選取碳源牛肉膏+葡萄糖(1∶1) (g)、氮源蛋白胨(g)、無機(jī)離子氯化鈉(g)3個(gè)因素來研究發(fā)酵培養(yǎng)基最佳條件,以菌落總數(shù)為響應(yīng)值,利用Design-Exper.8.05軟件設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)(表1)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 最優(yōu)發(fā)酵條件

        通過設(shè)置不同時(shí)間、溫度、初始pH值、搖瓶轉(zhuǎn)速優(yōu)化菌株YB-81的發(fā)酵條件,結(jié)果如圖1~圖4所示。菌落總數(shù)與抑菌率的變化趨勢(shì)基本一致,菌落總數(shù)越高,抑菌率也越高。發(fā)酵時(shí)間36 h抑制率達(dá)最高80.6%,菌落總數(shù)16.6億個(gè)·mL-1;隨著發(fā)酵溫度的上升菌落總數(shù)逐漸增多,在36 ℃時(shí)發(fā)酵代謝物此時(shí)的抑菌作用最強(qiáng),菌落生長總數(shù)也最多,40 ℃ 時(shí)抑制率明顯降低;pH值8.0時(shí),抑制率和菌落總數(shù)均在最高點(diǎn),與其他處理差異顯著;芽孢桿菌在5個(gè)不同搖床轉(zhuǎn)速條件下,抑制率變化不明顯,菌落總數(shù)逐漸增多,在200 r·min-1菌落總數(shù)達(dá)到最大值16.2億個(gè)·mL-1。

        2.2 生防芽孢桿菌YB-81發(fā)酵培養(yǎng)基試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        通過單因素試驗(yàn),得出發(fā)酵培養(yǎng)基(100 mL)中最佳碳源葡萄糖+牛肉膏(1∶1)添加量為0.5 g,最佳氮源蛋白胨1.0 g,最佳無機(jī)離子氯化鈉0.20 g。

        2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基

        2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 以菌落總數(shù)為響應(yīng)值,利用Design-Exper.8.05軟件設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn),菌落總數(shù)響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)結(jié)果見表2。

        根據(jù)軟件對(duì)表2中試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,得到生防芽孢桿菌培養(yǎng)基設(shè)計(jì)過程中A碳源、B氮源、C無機(jī)離子的二次多項(xiàng)回歸模型:

        Y=+177.60+2.00A-5.88B+1.62C+9.75AB+0.25AC-1.50BC-88.30A2-27.05B2-45.55C2

        2.3.2 響應(yīng)曲面方差分析 通過表3可以看出,該模型的F值為38.03說明模型是顯著的,各因素中BC和B2顯著;均二次方A2、C2極顯著。

        2.3.3 響應(yīng)曲面圖與等高值線圖的分析 交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可用等高線的形狀來映出, 橢圓形表示兩因素交互作用顯著, 而圓形則與之相反。由圖4~圖6可知,碳源葡萄糖+牛肉膏(1∶1)(A)、氮源蛋白胨(B)、無機(jī)離子氯化鈉(C)之間的相互作用對(duì)菌落總數(shù)的影響。

        如圖中4所示,碳源與氮源之間存在交互作用,當(dāng)碳源在零水平時(shí),在氮源增加的同時(shí),菌落總數(shù)也逐漸增加,當(dāng)碳源超過0.5 g以后,菌落總數(shù)不再增加。從等高線圖中可直觀看出兩因素交互作用不顯著。

        圖5顯示了碳源與無機(jī)離子之間交互作用不顯著,從其等高線可直觀看出,因?yàn)榈雀呔€的形狀反應(yīng)了交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小,圓形表示兩個(gè)因素作用不顯著。

        由圖6可知,把氮源加入量固定于零水平(1.0 g)時(shí),氮源與培養(yǎng)基中無機(jī)離子交互影響效應(yīng)特點(diǎn)是:隨著氮源的變化,菌落總數(shù)先上升后降低;適當(dāng)?shù)脑黾拥纯梢詼p少一定量無機(jī)離子。說明氮源與無機(jī)離子有一定的交互作用。

        以上3個(gè)響應(yīng)面均為開口向下,說明響應(yīng)值(菌落總數(shù))存在極大值,3個(gè)圖形的等高線中心均位于-1~1之間,表明培養(yǎng)基最優(yōu)條件存在于所設(shè)計(jì)的因素水平范圍之內(nèi)。模型培養(yǎng)基優(yōu)化條件為:碳源0.53 g,氮源0.99 g, 無機(jī)離子0.20 g,在此條件下,模型預(yù)測菌落總數(shù)為168.408 ×107個(gè)·mL-1。

        2.3.4 模型驗(yàn)證 通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出全蝕病生防菌株YB-81發(fā)酵培養(yǎng)基的3個(gè)影響因素,模型理論條件牛肉膏+葡萄糖(1∶1)0.53%,蛋白胨0.99%,氯化鈉0.20%,這3個(gè)主要因素對(duì)菌株YB-81生長條件存在顯著影響。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),經(jīng)3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),取平均值,實(shí)際菌落總數(shù)為18.8億個(gè)·mL-1,與模型預(yù)測值基本相符,比基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了72%,對(duì)全蝕病菌抑制率達(dá)到87.2%,較優(yōu)化前提高了32.5%。

        3 結(jié)論與討論

        小麥全蝕病是小麥上的一種毀滅性病害,民間俗稱“小麥癌癥”。 枯草芽孢桿菌YB-81菌株經(jīng)過室內(nèi)生測、盆栽試驗(yàn)、田間試驗(yàn)已驗(yàn)證其對(duì)小麥全蝕病有較好的抑制作用,同時(shí)通過拌種處理,菌株進(jìn)入土壤,能夠改善土壤環(huán)境,對(duì)小麥全蝕病的長期預(yù)防與防治大有益處。目前該菌株專利已授權(quán)(專利號(hào)2010101 99739.1)。利用該生防菌株研發(fā)的微生物菌劑已經(jīng)得到了農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥大田試驗(yàn)批準(zhǔn)證書(農(nóng)藥試驗(yàn)證號(hào):SY201001691),已完成農(nóng)藥大田試驗(yàn),正在登記,該菌株在生產(chǎn)上的應(yīng)用前景廣泛。

        在大規(guī)模生產(chǎn)菌劑前,對(duì)菌株YB-81的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,能夠確定一套產(chǎn)率最大、最節(jié)約的發(fā)酵模式。傳統(tǒng)上對(duì)于生防菌株的發(fā)酵通常采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法[7-11],本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)模擬和優(yōu)化,直觀、可信度高[12],最終確定了一系列最優(yōu)發(fā)酵條件,使其對(duì)小麥全蝕病菌的抑制率提高32.5%,菌落總數(shù)提高72%。

        本試驗(yàn)中對(duì)生防菌株的發(fā)酵優(yōu)化是在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)行的,當(dāng)菌株進(jìn)一步中試生產(chǎn)時(shí),可以此發(fā)酵模式為基礎(chǔ),但發(fā)酵罐中的發(fā)酵條件還需進(jìn)一步的驗(yàn)證及研究。

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