張希勁　劉小強　高鈿　沈若武

[摘要]目的 探究穿心蓮內(nèi)酯（AG）對人骨肉瘤（HOS）細胞的作用及機制。方法 以正常培養(yǎng)的HOS細胞為對照組，不同濃度AG作用后的HOS細胞為實驗組。利用平板克隆實驗觀察AG對HOS細胞增殖能力的影響，Transwell實驗觀察AG對HOS細胞侵襲和遷移能力的影響，流式細胞術(shù)觀察AG對HOS細胞周期分布的影響。結(jié)果 與對照組相比，實驗組HOS細胞的生存率降低，抑制率升高，且呈現(xiàn)出濃度依賴性和時間依賴性，差異均有顯著性（F=111.64、35.22，P<0.05）。實驗組HOS細胞的增殖能力較對照組降低，也呈現(xiàn)出濃度依賴性，差異有顯著性（F=250.95，P<0.05）。與對照組相比，實驗組HOS細胞侵襲和遷移能力均降低，差異有顯著性（t=21.23、23.36，P<0.05）。與對照組相比，實驗組HOS細胞G1期比例降低，S期比例升高，G2期比例降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.12～38.88，P<0.05）;G1期濃度依賴性不明顯（t=0.16～0.40，P>0.05），S期、G2期則表現(xiàn)出一定的濃度依賴性（t=5.41～11.90，P<0.05）。結(jié)論 AG能夠明顯降低HOS細胞的生存率，這可能與其影響HOS細胞的增殖能力、侵襲和遷移能力及細胞周期有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 穿心蓮內(nèi)酯;骨肉瘤;細胞增殖;細胞運動;細胞周期

[中圖分類號] R738.1[文獻標志碼] A[文章編號] 2096-5532（2020）04-0451-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.043

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200320.1519.005.html;2020-03-23 13：41：57

EFFECT OF ANDROGRAPHOLIDE ON HUMAN OSTEOSARCOMA CELLS AND ITS MECHANISM OF ACTION

ZHANG Xijin， LIU Xiaoqiang， GAO Tian， SHEN Ruowu

（Department of Special Medicine， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266021， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of andrographolide （AG） on human osteosarcoma （HOS） cells and its mechanism of action.Methods Normally cultured HOS cells were selected as control group and HOS cells treated with different concentrations of AG were selected as experimental group. Plate colony formation assay was used to observe the effect of AG on the proliferative capacity of HOS cells， Transwell assay was used to observe the effect of AG on the invasion and migration abilities of HOS cells， and flow cytometry was used to observe the effect of AG on HOS cell cycle distribution. Results Compared with the control group， the experimental group had a significant reduction in the viability of HOS cells and a significant increase in inhibition rate in a concentration- and time-dependent manner （F=111.64，35.22;P<0.05）. Compared with the control group， the experimental group had a significant reduction in proliferative capacity in a concentration-dependent manner （F=250.95，P<0.05）， as well as significant reductions in the invasion and migration abilities of HOS cells （t=21.23，23.36;P<0.05）. Compared with the control group， the experimental group had a significant reduction in the proportion of cells in G1 phase， a significant increase in the proportion of cells in S phase， and a significant reduction in the proportion of cells in G2 phase （t=4.12-38.88，P<0.05）; the change in the cells in G1 phase was not concentration-dependent （t=0.16-0.40，P>0.05）， and the changes in the cells in S phase and G2 phase showed a certain degree of concentration dependence （t=5.41-11.90，P<0.05）.Conclusion AG can significantly reduce the viability of HOS cells， possibly by affecting the proliferation， invasion， migration， and cell cycle of HOS cells.

[KEY WORDS] andrographolide; osteosarcoma; cell proliferation; cell movement; cell cycle

穿心蓮是一種臨床應(yīng)用極為廣泛的中藥[1]，其藥用部位為爵床科植物穿心蓮的干燥地上部分。該藥具有清熱解毒、涼血、消腫、燥濕等功效[2]，臨床常用于治療呼吸道感染、泌尿系感染、腹瀉、濕疹及癰瘡等病癥[3-6]。近年來國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮的主要成分穿心蓮內(nèi)酯（AG）具有良好的抗腫瘤活性，對多種腫瘤具有很好的療效，例如肺癌[7]、卵巢癌[8]、膠質(zhì)母細胞瘤[9]、前列腺癌[10]等。但AG對骨肉瘤的作用卻一直鮮有研究。本研究旨在探討AG對人骨肉瘤（HOS）細胞生物學(xué)行為的影響及其作用機制，從而為臨床骨肉瘤的治療提供一定的參考?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)與分組

HOS細胞由青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院特種醫(yī)學(xué)系實驗室提供，用含體積分數(shù)0.10胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）和體積分數(shù)0.01青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞貼壁程度達到80%～90%時，進行傳代或其他實驗操作。以正常培養(yǎng)的HOS細胞為對照組，不同濃度AG（北京索萊寶科技有限公司）作用后的HOS細胞為實驗組。

1.2 平板克隆實驗檢測細胞增殖能力

取生長狀態(tài)良好的細胞1瓶，應(yīng)用2.5 g/L的EDTA胰蛋白酶溶液消化，收集細胞。每組設(shè)3個復(fù)孔，以每孔2×104個細胞接種于24孔板中，貼壁生長24 h。去掉原培養(yǎng)液，分別加入不含AG和含有1、2、5、10 μmol/L AG的培養(yǎng)液1 mL，培養(yǎng)2周，中間及時換液。棄培養(yǎng)液，甲醇固定后以10 g/L結(jié)晶紫染色液（北京索萊寶科技有限公司）染色。用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去浮色，自然風(fēng)干后拍照。

1.3 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲和遷移能力

取生長狀態(tài)良好的細胞1瓶，接種在6孔板中，每孔106個細胞，貼壁生長過夜。棄去舊培養(yǎng)液，分別加入2 mL不含AG和含有50 μmol/L AG的培養(yǎng)液作用48 h。按基質(zhì)膠∶無血清培養(yǎng)液=1∶8的比例稀釋基質(zhì)膠，取100 μL按比例稀釋后的基質(zhì)膠鋪于Transwell試劑盒（康寧公司）上室，過夜。分別設(shè)鋪膠組和不鋪膠組，鋪膠組測侵襲能力，不鋪膠組測遷移能力。收集細胞，離心，去上清，用無血清培養(yǎng)液重懸。上室接種5×104個HOS細胞，下室加入含體積分數(shù)0.20胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液500 μL，作用48 h。取出小室，吸除上室培養(yǎng)液，棉簽擦凈，甲醇固定后用10 g/L結(jié)晶紫染色液染色。用PBS洗去浮色后，棉簽再次擦凈未穿膜細胞，晾干，倒置顯微鏡（奧林巴斯公司）下拍照。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布

取生長狀態(tài)良好的細胞4瓶，以PBS清洗后，每瓶加3 mL無血清RPMI-1640培養(yǎng)液同步化過夜。同步化處理以后，棄去培養(yǎng)液，4瓶分別加入3 mL不含AG以及含有5、10、50 μmol/L AG的RPMI-1640培養(yǎng)液。作用24 h后，收集細胞，用冰預(yù)冷PBS清洗，離心，去上清，加入500 μL冰預(yù)冷的體積分數(shù)0.70的乙醇溶液重懸，4 ℃固定過夜。離心，去上清，用冰預(yù)冷PBS清洗乙醇。再次離心，去上清，按照細胞周期檢測試劑盒（金克隆生物技術(shù)有限公司）說明書的要求處理沉淀。處理沉淀后應(yīng)用流式細胞儀（賽默飛世爾科技有限公司）檢測細胞周期分布。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料結(jié)果以[AKx-D]±s表示，兩組數(shù)據(jù)之間比較采用配對t檢驗，多組數(shù)據(jù)之間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AG對HOS細胞生存率的影響

與對照組相比較，實驗組HOS細胞的生存率降低，抑制率升高，且呈現(xiàn)出濃度依賴性和時間依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=111.64、35.22，P<0.05），濃度和時間無交互作用（F=0.33，P>0.05）。表明AG能夠降低HOS細胞生存率。見表1。

2.2 AG對HOS細胞增殖能力的影響

平板克隆實驗結(jié)果顯示，在AG濃度分別為0、1、2、5、10 μmol/L的條件下，HOS細胞的增殖率分別為100%、（82.87±3.62）%、（66.83±2.40）%、（46.83±3.26）%和（22.83±1.63）%（n=3），實驗組HOS細胞的增殖能力明顯低于對照組，且呈現(xiàn)出濃度依賴性，差異有顯著性（F=250.95，P<0.05）。說明AG可以降低HOS細胞的增殖能力。

2.3 AG對HOS細胞侵襲和遷移能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，實驗組HOS細胞的侵襲和遷移能力均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=21.23、23.36，P<0.05）。表明AG能夠降低HOS細胞的侵襲和遷移能力。見表2。

2.4 AG對HOS細胞周期分布的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，AG濃度與細胞周期存在交互作用（F=514.77，P<0.05）;與對照組相比，各實驗組HOS細胞G1期比例降低，S期比例升高，G2期比例降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.12～38.88，P<0.05）;G1期的濃度依賴性不明顯（t=0.16～0.40，P>0.05），S期、G2期則體現(xiàn)出一定的濃度依賴性（t=5.41～11.90，P<0.05）。表明AG能夠影響HOS細胞的周期分布，阻滯其由S期至G2期。見表3。

3 討論

骨肉瘤是一種多發(fā)于青少年和兒童的原發(fā)性惡性骨腫瘤，發(fā)病年齡多在13～19歲之間，男性多于女性。骨肉瘤具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移早、發(fā)展快、預(yù)后差等4個特點[11]。現(xiàn)階段骨肉瘤的臨床治療以手術(shù)聯(lián)合新輔助化療為主[12]。此外，基因治療、分子靶向治療、免疫治療等新治療技術(shù)的應(yīng)用也取得了一定進展[13-20]。雖然骨肉瘤的臨床治療已經(jīng)取得了長足的進步，但仍然存在很多局限性[21-22]，如化療的毒副作用較大[23]，放療對骨肉瘤的敏感性相對較差，復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性骨腫瘤缺乏有效的靶向治療藥物，骨肉瘤篩查率低，針對惡性腫瘤的標記物篩查缺少相應(yīng)有效的研究等，這些都是現(xiàn)階段骨肉瘤臨床治療中存在的問題[24]，仍有待進一步的研究。

相對西藥來說，中藥的毒副作用要小很多。近年來的研究結(jié)果表明，很多中藥具有良好的抗腫瘤功效[25-26]，如柴胡、黃芩、大黃、蚤休、穿心蓮等。穿心蓮作為臨床抗腫瘤的代表性藥物之一，其主要成分AG具有良好的抗腫瘤活性，對多種腫瘤有效，包括肝癌、胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌等[27-29]。然而，國內(nèi)外極少有AG對骨肉瘤影響的研究報道，其作用機制更是不甚明了。因此，本研究探討了AG對骨肉瘤細胞生物學(xué)行為的影響，以期發(fā)現(xiàn)新的可以用于骨肉瘤臨床治療的潛在藥物。

藥物對腫瘤的抑制作用主要體現(xiàn)在誘導(dǎo)細胞凋亡、阻滯細胞周期、抑制細胞侵襲和遷移、調(diào)節(jié)機體免疫等方面[30]。本文研究結(jié)果顯示，AG能夠顯著降低HOS細胞的生存率，且濃度越高，作用時間越長，HOS細胞的生存率越低，表明AG對HOS細胞有抑制作用。進一步的平板克隆實驗結(jié)果表明，AG能夠降低HOS細胞的增殖能力，濃度越高，HOS細胞的增殖能力越低。Transwell實驗結(jié)果表明，AG能夠抑制HOS細胞的侵襲和遷移。流式細胞術(shù)結(jié)果則表明，AG可以影響HOS細胞的周期分布，阻滯其由S期至G2期的過程，進而影響HOS細胞的增殖。以上結(jié)果說明，AG能夠通過影響HOS細胞的增殖、侵襲遷移能力以及細胞周期分布等，發(fā)揮對HOS細胞的抑制作用，表明AG可能是一種潛在的治療骨肉瘤的藥物。

綜上所述，本研究首次探討了AG對骨肉瘤細胞的作用，證明了AG對HOS細胞的影響是多方面的，包括增殖能力、侵襲和轉(zhuǎn)移能力以及細胞周期分布等，表明AG對HOS細胞有較強的抑制作用，可能是一種潛在的治療骨肉瘤的藥物。然而，本實驗也存在局限性，如只證明了AG對HOS細胞有顯著抑制作用，并初步探討了其作用機制，而尚未探究AG對HOS細胞的分子作用機制，這將是我們后續(xù)研究的重點。希望本研究結(jié)果能夠有助于發(fā)現(xiàn)更多的能夠安全有效治療骨肉瘤的藥物，進而對臨床治療骨肉瘤有所幫助。

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（本文編輯 馬偉平）

[收稿日期]2019-04-05; [修訂日期]2020-02-18

[基金項目]山東省高等學(xué)校科技計劃項目（L16LK04）

[第一作者]張希勁（1993-），男，碩士研究生。

[通信作者]沈若武（1973-），男，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：shenruowu@aliyun.com。