沈彥輝　陳宏坤　高璐陽　徐廣飛　付強強

摘要：本研究選取灰葡萄孢菌株BC 05.10為試材，克隆Bctre1基因的核苷酸序列并對其進行生物信息學(xué)分析，同時采用熒光定量PCR法研究該基因在不同侵染時期、分生孢子萌發(fā)過程中以及不同碳源、海藻糖誘導(dǎo)下的表達(dá)情況。結(jié)果表明：該基因ID號為5428296，全長3 341 bp，位于scaffold_17負(fù)鏈的495 880～499 211位置，與核盤菌Sstre1的同源關(guān)系較近; BcTRE1蛋白由1 033個氨基酸殘基編碼組成，該蛋白N端具有2個6發(fā)卡結(jié)構(gòu)的超糖苷酶家族和1個C端糖基水解酶家族63。熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨著侵染時間的延長Bctre1表達(dá)量顯著增加（P<0.05），48 h后表達(dá)量增加不顯著;Bctre1在分生孢子萌發(fā)24 h時表達(dá)量最高;Bctre1在海藻糖為單一碳源的培養(yǎng)基中表達(dá)量最高，在海藻糖誘導(dǎo)下12 h 后Bctre1表達(dá)量顯著增加（P<0.05）。綜上，Bctre1與侵染寄主過程中分生孢子萌發(fā)及不同碳源利用密切相關(guān)，在侵染后期對促進菌絲生長發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：灰葡萄孢;Bctre1;基因組定位;蛋白結(jié)構(gòu);表達(dá)分析

中圖分類號：S432.4+4：Q78文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2020）03-0013-06

Abstract In this study， the Botrytis cinerea ?strain BC 05.10 was selected as test material， and the nucleotide sequence of Bctre1 gene were cloned and analyzed by bioinformatics method. The expression of Bctre1 gene at different infection stages， in the process of conidia germination， and under different carbon sources and trehalose induction were studied by fluorescence quantitative PCR method. The results showed that the gene ID number was 5428296， and its total length was 3 341 bp， which was located at 495 880～499 211 sites of the negative chain of scaffold_17. The homologous relationship between Bctre1 and Sstre1 was close. The protein encoded by Bctre1 gene contained 1 033 amino acid residues and had two 6-hairpin structure super glucosidase family and one C-terminal glycosyl hydrolase family 63. The results of fluorescence quantitative PCR showed that the expression of Bctre1 increased significantly with the increase of infection time （P<0.05）， while the increase of Bctre1 expression after 48 h was not significant. The expression of Bctre1 was the highest when conidia germinated for 24 h and the trehalose was used as the single carbon source in medium， and it increased significantly after 12 h under trehalose induction （P<0.05）.In summary， Bctre1 was closely related to conidia germination and different carbon source utilization during the process of infecting host， and played an important role in promoting mycelial growth at late stage of infection.

Keywords Botrytis cinerea; Bctre1; Genome location; Protein structure; Expression analysis

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染寄主廣泛，有遺傳變異大、繁殖快、侵染性強等特點。它已對多種殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，但農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中為防止灰霉病的發(fā)生，大多采用加大殺菌劑使用量的方法，這對農(nóng)產(chǎn)品的安全性造成了嚴(yán)重威脅[1，2]。海藻糖是一種普遍的儲藏性糖類， 有研究表明，其參與真菌的生長發(fā)育、代謝反應(yīng)、逆境脅迫、產(chǎn)孢和致病力等途徑[3-6]。海藻糖酶（trehalase，Tre）能抑制海藻糖合成，當(dāng)真菌體內(nèi)的海藻糖含量降低時，其生長發(fā)育與致病性均受到影響。例如，海藻糖酶能抑制假絲酵母和稻瘟病菌在寄主體內(nèi)的存活[3]。黑曲霉缺失treB基因可使分生孢子發(fā)育受限和致病力下降[7]。白色念珠菌缺失treB基因可導(dǎo)致致病力下降[4]。Foster等[8]研究結(jié)果表明，稻瘟病菌（Magnaprothe grisea）中編碼中性海藻糖酶的基因NTH1突變會引起病菌在寄主組織內(nèi)擴展能力下降，導(dǎo)致致病力下降。Doehlemann等[9]認(rèn)為海藻糖酶基因不影響灰葡萄孢的致病力，但可以調(diào)控孢子的萌發(fā)率和影響孢子的熱耐受能力，tre基因缺失突變體孢子萌發(fā)率下降[9]。

當(dāng)前，昆蟲、線蟲和動物寄生線蟲海藻糖酶基因的研究取得一系列進展，但關(guān)于植物病原真菌海藻糖酶基因的研究相對較少。本試驗擬利用同源克隆技術(shù)獲得Bctre1基因，采用軟件對其結(jié)構(gòu)特征進行分析，用實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）檢測不同侵染時期、分生孢子萌發(fā)過程及不同碳源、海藻糖誘導(dǎo)下Bctre1的表達(dá)情況，旨在為研究灰葡萄孢Bctre1基因在其生長、發(fā)育及侵染過程的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 灰葡萄孢（Botrytis cinerea）野生型菌株BC 05.10由養(yǎng)分資源高效開發(fā)與綜合利用國家重點實驗室保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯切碎加蒸餾水煮30 min后過濾，濾液加入20 g葡萄糖、15 g瓊脂，加水定容至1 L。水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂12 g，加水定容至1 L。改良Fries培養(yǎng)基：蔗糖30 g、酒石酸胺5 g、NaCl 0.1 g、CaCl2 0.1 g、KH2PO4 1 g、NH4NO3 1 g、MgSO4 0.5 g、酵母浸膏0.5 g、瓊脂12 g，加水定容至1 L。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒（MiniBEST Universal RNA Extraction Kit）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT Reagent Kit With gDNA Eraser）、Real-Time PCR試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ）均購于TaKaRa公司。凝膠成像系統(tǒng)，北京賽創(chuàng)科技有限公司產(chǎn)品;紫外分析儀，北京新技術(shù)應(yīng)用研究所產(chǎn)品;DYCP-31DN型瓊脂糖水平電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品;TGL-16G型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品;CFX96 Real-Time PCR Detection System，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品）。

1.3 Bctre1的生物信息學(xué)分析用RNA提取試劑盒提取灰葡萄孢基因組的RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計Bctre1的擴增引物（Bctre1-F：5′-TCACATCTTCCATCTACGACGA-3′;Bctre1-R：5′-TCCATGAGACTTTACAAACCAGA-3′）。擴增體系 （25 μL）： cDNA模板2.0 μL，2.5 μmol/L dNTP ?10.0 μL， 10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，10×PCR buffer 2.0 μL，ddH2O 9.8 μL。擴增程序： 95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次;72℃終延伸 10 min。用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

通過Blast搜索Botrytis cinerea基因組數(shù)據(jù)庫（JGI，https：//genome.jgi.doe.gov/Botci1/Botci1.home.html），確定Bctre1在基因組中的精確位置。利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用在線軟件ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）分析核酸及氨基酸序列、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)。利用在線軟件InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）對BcTRE1蛋白的功能域進行預(yù)測。分別利用SOMPA和Phyre 2軟件分析和預(yù)測BcTRE1蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)[10-13]。

1.4 灰葡萄孢病菌侵染過程中Bctre1的表達(dá)分析

將灰葡萄孢病菌BC 05.10接種于PDA平板上，23℃暗培養(yǎng)3 d。采用直徑為1 cm的打孔器自PDA培養(yǎng)基上制取菌餅，保濕24～72 h后接種大豆葉片，并分別于接種后0、6、12、24、48、72 h剪取80～100 mg菌餅下方的大豆葉片，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ?8S rRNA作為內(nèi)參基因，Real-Time PCR所用引物同1.3，均由上海生工生物工程有限公司合成。采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取灰葡萄孢病菌不同侵染時期樣品的RNA，采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進行cDNA的合成。美國伯樂公司CFX96熒光定量PCR儀，以不同侵染時期的cDNA為模板，用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）試劑盒進行Real-Time PCR擴增。擴增體系（25 μL）：2×SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序：95℃ 30 s;95℃ 5 s;60℃ 30 s，40個循環(huán);95℃ 5 s;60℃ 30 s。每個樣品技術(shù)性重復(fù)4次，生物學(xué)重復(fù)3次。

1.5 灰葡萄孢病菌分生孢子萌發(fā)過程中Bctre1的表達(dá)分析

把玻璃紙置于水瓊脂上，然后將灰葡萄孢菌株BC 05.10接種到該平板置于26℃暗培養(yǎng)，分別收集6、12、18、24 h的分生孢子，提取不同萌發(fā)時期分生孢子RNA，并進行cDNA的合成。檢測不同階段的表達(dá)規(guī)律，方法同1.4。

1.6 不同碳源培養(yǎng)下Bctre1的表達(dá)分析

將灰葡萄孢病菌菌株BC 05.10培養(yǎng)于改良的固體Fries培養(yǎng)基，分別將碳源換成1%的葡萄糖、海藻糖、蔗糖、果膠和甘油，26℃暗培養(yǎng)4 d，收集菌絲提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。Bctre1表達(dá)情況的檢測方法同1.4。

1.7 海藻糖誘導(dǎo)下Bctre1的表達(dá)分析

將灰葡萄孢病菌菌株BC 05.10培養(yǎng)于改良的固體Fries培養(yǎng)基，將碳源換成1%的海藻糖，以不加碳源為對照，26℃暗培養(yǎng)4 d，收集菌絲提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Real-Time PCR方法檢測Bctre1表達(dá)情況，方法同1.4。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)整理并作圖，用SAS 8.1軟件中Turkey法進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bctre1的生物信息學(xué)分析

2.1.1 Bctre1基因cDNA編碼區(qū)的克隆 以反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA為模板，以Bctre1-F和Bctre1-R為引物，PCR擴增結(jié)果如圖1所示，目的片段約為3 300 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。膠回收目的片段測序后，可得Bctre1 cDNA長度為3 332 bp。

2.1.2 Bctre1在基因組中的定位 以前期擴增到的Bctre1基因序列為探針序列，利用Blastn搜索灰葡萄孢基因組數(shù)據(jù)庫，得到基因ID號為5428296，基因全長3 341 bp，位于scaffold_17負(fù)鏈的495 880～499 211位置。

2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 利用MEGA 4.0軟件對Bctre1與核盤菌、柄孢霉的tre1核苷酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，可知，Bctre1與核盤菌Sstre1同源關(guān)系較近（圖2）。

2.1.4 理化性質(zhì)分析 BcTRE1蛋白含有1 033個氨基酸殘基，分子量為120 195.19，理論等電點5.48，預(yù)測該蛋白280 nm處的吸光度為2.035～2.031，不穩(wěn)定系數(shù)為43.26，平均疏水性為-0.769。

2.1.5 保守功能域分析 BcTRE1蛋白序列在線分析結(jié)果表明，其N端有2個6發(fā)卡結(jié)構(gòu)的超糖苷酶家族，分別位于398～674、723～902氨基酸殘基位置。其中723～812氨基酸殘基位置還有1個C端糖基水解酶家族63（圖3）。

2.1.6 BcTRE1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 BcTRE1蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，該蛋白中無規(guī)則卷曲的含量為48.23%，由423個氨基酸殘基構(gòu)成;α-螺旋的含量為41.82%;β-折疊含量較少，占15.85%;β-轉(zhuǎn)角含量最少，僅占8.32%（圖4）。

2.2 Bctre1表達(dá)特性分析

2.2.1 不同侵染時期Bctre1的表達(dá)特性 由圖5可以看出，一定范圍（0～48 h）內(nèi)，隨著侵染時間的延長，Bctre1基因的表達(dá)量顯著增加;72 h時，表達(dá)量雖有增加，但與48 h的相比未達(dá)顯著水平。這可能是由于侵染48 h后，灰葡萄孢病菌體內(nèi)的海藻糖酶含量達(dá)到臨界點，產(chǎn)生的海藻糖酶用于清除體內(nèi)多余的海藻糖造成的。

2.2.2 灰葡萄孢分生孢子生長過程中tre1基因的表達(dá)規(guī)律 Bctre1基因表達(dá)量隨培養(yǎng)時間延長升高明顯（圖6），表明Bctre1基因的表達(dá)量與灰葡萄孢分生孢子生長呈正相關(guān)，推測Bctre1基因參與灰葡萄孢分生孢子萌發(fā)侵染過程。

2.2.3 不同碳源培養(yǎng)下Bctre1的表達(dá)分析 由圖7可以看出，Bctre1基因表達(dá)量在以海藻糖為碳源的培養(yǎng)基中最高，約是以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中表達(dá)量的2倍。這可能是Bctre1基因?qū)⒑Ｔ逄欠纸獬蓛煞肿悠咸烟窃斐傻模f明Bctre1基因促進海藻糖的分解， 葡萄糖與灰葡萄孢的生長發(fā)育有關(guān)。Bctre1基因在果膠培養(yǎng)基中的表達(dá)量與在葡萄糖培養(yǎng)基中的差異不顯著（P>0.05），表明Bctre1在一定程度上能將果膠轉(zhuǎn)化為灰葡萄孢可利用的糖源物質(zhì)。甘油培養(yǎng)基中的Bctre1表達(dá)量最低，這可能是由于葡萄孢不能將甘油轉(zhuǎn)化成其可利用的糖源物質(zhì)的緣故。

2.2.4 海藻糖誘導(dǎo)下Bctre1基因的表達(dá)分析

[JP2]由圖8可以看出，海藻糖誘導(dǎo)的Bctre1基因表達(dá)量高于未誘導(dǎo)，處理12 h后，差異達(dá)顯著水平（P<0.05），[JP]24 h時表達(dá)量最高。結(jié)合2.2.1和2.2.2中Bctre1基因的表達(dá)規(guī)律，得出海藻糖可能與灰葡萄孢及其分生孢子的侵染有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

本研究通過PCR擴增得到Bctre1 基因，并運用生物信息學(xué)技術(shù)確定該基因位于灰葡萄孢基因組scaffold_17負(fù)鏈的495 880～499 211位置，全長為3 341 bp。通過核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，Bctre1與Sstre1同源關(guān)系較近。Bctre1的基因保守結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，該蛋白的N端有2個6發(fā)卡結(jié)構(gòu)的超糖苷酶家族，分別位于398～674、723～902氨基酸殘基位置，其中723～812氨基酸殘基位置還有1個C端糖基水解酶家族63。

植物病原真菌中tre1的功能已有報道。Petitjean等[4]研究發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌（Candida albicans）的tre基因與致病力有關(guān)，敲除tre基因后其致病力下降。Svanstrm等[7]研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉（Aspergillus niger）中treB基因與分生孢子的產(chǎn)生和海藻糖酶有關(guān)，treB突變菌株分生孢子梗只能產(chǎn)生少數(shù)有活力的分生孢子，而且不能降解分生孢子萌發(fā)過程中的胞內(nèi)海藻糖。本研究發(fā)現(xiàn)， Bctre1在菌絲侵染后期和分生孢子生長后期表達(dá)量最大，表明tre1基因在灰葡萄孢侵染時發(fā)揮重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同碳源培養(yǎng)基上Bctre1基因的表達(dá)量不同，其在海藻糖培養(yǎng)基中表達(dá)量是葡萄糖培養(yǎng)基中的2倍，因此，脅迫條件下灰葡萄孢利用tre1基因?qū)⒑Ｔ逄欠纸獬善咸烟?，為其生長提供糖源。此外，海藻糖誘導(dǎo)情況下， Bctre1基因表達(dá)量顯著增加，而此階段的菌絲生長速率也較快，這可能與灰葡萄孢及其分生孢子的侵染有關(guān)。本試驗初步證實了海藻糖酶與灰葡萄孢的菌絲和分子孢子生長發(fā)育的關(guān)系，證實Bctre1在灰葡萄孢侵染過程中發(fā)揮作用。但若要深入了解該基因的功能和機制，還需要從基因水平和蛋白質(zhì)水平進行功能研究，探究其在灰葡萄孢生長、發(fā)育及侵染過程中的具體作用機制。

綜上所述，Bctre1基因受灰葡萄孢生長發(fā)育和逆境脅迫因子誘導(dǎo)表達(dá)，推測其可能是調(diào)控灰葡萄孢侵染寄主及侵染后菌絲生長的關(guān)鍵基因。

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