宋晴晴　張慧敏　張燁　張一卉　李景娟　李化銀　賀立龍　王鳳德　高建偉

摘要：大白菜是我國分布最廣、種植面積最大的蔬菜作物，其豐產對安定人民生活起著舉足輕重的作用。GID1蛋白是赤霉素信號轉導過程中的重要受體，在調控植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。本研究采用生物信息學分析方法對大白菜基因組中GID1家族基因進行鑒定，并對該基因結構、染色體分布、系統(tǒng)進化以及表達模式等進行分析。結果表明，大白菜基因組中含有5個GID1家族成員，分別位于4、5、6、7、9號染色體上，各家族成員都只含有1個內含子。系統(tǒng)進化結果顯示，單子葉和雙子葉植物的GID1蛋白明顯處于兩個不同分支，大白菜GID1家族成員與擬南芥GID1具有更近的親緣關系。通過表達模式以及啟動子順式響應元件分析發(fā)現，大白菜GID1基因不僅參與生長發(fā)育調控還可能參與對不同環(huán)境因子的響應過程。

關鍵詞：大白菜;GID1基因;生物信息學分析;表達模式分析

Abstract： Chinese cabbage is the vegetable with the widest distribution and the largest planting area in China. Its yield plays an important role in the stability of the people's life. GID1 protein is an important receptor in the process of gibberellin signal transduction and plays an important role in regulating plant growth and development. In this study， the GID1 family genes in the Chinese cabbage genome were identified by bioinformatics methods， and their gene structure， chromosome distribution， phylogenetics and expression patterns were analyzed. The results showed that the Chinese cabbage genome contained 5 GID1 gene members and was evenly distributed on chromosomes 4， 5， 6， 7 and 9. In addition， members of the Chinese cabbage GID1 family contain only one intron. In phylogenetic evolution， the GID1 family of proteins has distinct branches between dicotyledons and monocotyledons， while the GID1 family members of Chinese cabbage have a closer genetic relationship with Arabidopsis GID1. Through expression pattern and promoter cis-element analysis， it was found that the GID1 gene of Chinese cabbage not only participates in the regulation of growth and development but also may participate in the response process to different environmental factors. This study not only provides clues for us to understand the function of GID1 gene in Chinese cabbage， but also provides an important reference for further application in molecular breeding of Chinese cabbage.

Key words： Chinese cabbage; GID1 gene;Bioinformatics analysis; Expression pattern analysis

大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）起源于中國，常年種植面積2×106 hm2左右，總產約1億噸，是種植面積、產量最大的蔬菜作物，素有“國菜”之稱。長期生產實踐表明，大白菜產量與葉球大小直接相關并且受嚴格的遺傳控制。因此，挖掘參與調控大白菜葉球大小的相關基因將不僅有助于闡明葉球發(fā)育的分子調控機制，還有助于通過分子輔助育種手段提高大白菜產量。

赤霉素（gibberellin， GA）作為一種重要的植物激素，參與調控植物生長和發(fā)育，如種子萌發(fā)、植株生長、花器官形成以及果實發(fā)育等[1，2]。GID1（GIBBERELLIN-INSENSITIVE DWARF1）蛋白是赤霉素信號轉導過程中的重要受體，能特異性地結合活性GA，并進一步與DELLA蛋白結合形成復合體[3，4]。而這個復合體可以被特定的泛素E3連接酶復合體（SCFSLY1/GID2）多聚泛素化后被26S蛋白酶降解，從而產生GA效應[5]。2005年，人們在水稻中首次發(fā)現GID1蛋白，gid1-1突變體表現為植株矮化，對GA不敏感[6]。Nakajima等[7]研究發(fā)現擬南芥基因組存在GID1a、GID1b和GID1c三個成員，進一步研究[8]表明，三個成員中任何一個發(fā)生功能缺失突變對植株表型幾乎沒有影響，但同時發(fā)生功能缺失突變則可導致植株極其矮小，對GA完全不敏感。最近，Illouz-Eliaz等[2]發(fā)現另一種模式植物番茄基因組中也存在三個GID1成員，同樣是在三者同時發(fā)生功能缺失時出現植株極其矮小的表型，從而說明GID1不同成員間存在功能冗余。然而，Cheng等[9]對桃樹兩個GID1成員的研究發(fā)現，一個基因（GID1c）發(fā)生突變即可導致植株矮小。因此，對于不同植物而言，GID1成員在調控生長發(fā)育的過程中存在一定分化，并且GID1基因在調控植物大小的發(fā)育過程中發(fā)揮作用。但目前尚未見關于大白菜GID1基因的研究報道。

基于上述分析，本研究首先在大白菜全基因組水平上對GID1家族基因進行鑒定，后對其在染色體上的分布、基因結構、系統(tǒng)進化以及表達模式等進行分析，以期了解GID1基因功能，并為其在大白菜分子育種中的進一步應用提供參考。

1材料與方法

1.1 大白菜GID1基因鑒定

本研究從擬南芥基因組網站（https：//www.arabidopsis.org/）下載了擬南芥GID1家族成員的蛋白序列，并以其為探針分別在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）和大白菜基因組網站（http：//brassicadb.org/brad/）上進行BLAST檢索。提取最優(yōu)比對結果，然后利用在線軟件SMART （http：//smart.embl-heidelberg.de）對候選基因進一步驗證，確保其含有HGG和GXSXG蛋白保守結構域。

1.2 生物信息學分析

利用ExPASy Proteomics Server 工具（http：//www.expasy.org/tools）中提供的ProtParam軟件進行轉錄因子蛋白的分子量、理論等電點分析，GSDS軟件（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析內顯子/外含子結構，MEME軟件（http：//meme.nbcr.net/meme/）分析保守基序（Motif），SMART 軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de）分析保守結構域，DNAMAN軟件進行氨基酸序列的多重比對分析，MEGA6.0軟件進行系統(tǒng)進化分析，MapChart軟件進行染色體分布分析，PlantCARE軟件（http：//bioinform-atics.psb.ugent.be/webtools/pla-ntcare/html/）進行啟動子區(qū)順式作用元件分析。

番茄、水稻和玉米GID1家族成員的氨基酸序列下載自Phytozome基因組網站（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。

1.3 大白菜GID1基因表達模式分析

參照Tong等[10]的數據對BrGID1基因在大白菜根、莖、葉、花以及角果中的表達模式進行分析，RPKM值取對數值后利用TBtools軟件繪制熱圖。

不同葉位葉片BrGID1基因表達模式分析所用大白菜品種為西白16（山東登海種業(yè)股份有限公司西由種子分公司產品）和夏綠50（香港惟勤企業(yè)有限公司）。其中，成熟期，西白16植株較大，整株重約7 kg，而夏綠50較小，重約1.5 kg。選取飽滿一致的種子播于盛滿營養(yǎng)土的方形塑料盆（7 cm×7 cm）中。待幼苗長至第2片真葉完全展開時，向葉片正反面噴灑100 μmol/L GA3，以噴水為對照（CK），并在處理后0、1、3 h采集第1片真葉進行表達模式分析。待長至5葉期時（第5片葉完全展開），按從下到上的順序選取第1、3、5片葉作為樣品進行表達模式分析。

本研究使用天根生化科技（北京）有限公司的植物總RNA提取試劑盒（目錄號：DP432）提取RNA，寶生物工程（大連）有限公司的PrimeScript？ RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（目錄號：RR047A）合成cDNA、TB Green？ Fast qPCR Mix試劑盒（目錄號：RR430A）進行熒光實時定量PCR（RT-qPCR）。熒光實時定量PCR所用引物如表1所示，每個樣品設3次生物學重復，利用2-△△CT法計算基因的相對表達水平，再使用TBtools軟件繪制熱圖。

2結果與分析

2.1大白菜GID1基因家族成員鑒定

本研究利用相關軟件對候選基因進一步驗證發(fā)現，大白菜基因組中存在5個GID1家族基因。將這5個GID1基因與擬南芥GID1基因進行系統(tǒng)進化分析，發(fā)現Bra039460與AtGID1a基因在同一分支，Bra040420、Bra003520和Bra007722與AtGID1b基因在同一分支，而Bra009970則與AtGID1c基因位于同一分支（圖1A）。因此，參照擬南芥GID1基因家族的命名方法并進一步根據5個基因在染色體上的相對位置（圖1B），分別將其命名為BrGID1a、BrGID1b1、BrGID1b2、BrGID1b3和BrGID1c。利用GSDS軟件對大白菜GID1基因外顯子/內含子結構進行分析發(fā)現，5個成員均只含有一個內含子（圖1C）。另外，對大白菜GID1家族基因不同成員進行分析發(fā)現，其CDS序列長度介于1038～1191 bp，預測編碼蛋白長度在345～396aa之間，分子量在38503.73～44301.5 Da之間，等電點在6.21～6.79之間（表2）。

A：大白菜和擬南芥GID1基因系統(tǒng)進化分析;B：大白菜GID1基因在染色體上的位置分布;C：大白菜GID1基因外顯子/內含子結構分析（標尺代表基因長度，綠色部分代表外顯子區(qū)域，橫線部分代表內含子）。

2.2大白菜GID1蛋白保守基序分析

利用在線分析軟件MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/）對大白菜GID1家族蛋白的保守結構域進行預測，共得到10個Motif（保守基序）（圖2）。其中Motif1、2、4、5、6、7、9同時存在于5個BrGID1蛋白，Motif10存在于BrGID1a和BrGID1c中，而Motif3、8則僅存在于BrGID1b1、BrGID1b2和BrGID1b3中。因此，本研究推測Motif1、2、4、5、6、7、9可能是維持BrGID1家族蛋白基本功能所必需的，而其它保守結構域在不同成員上的差異分布則可能是導致不同成員功能差異的原因。

此外，通過對大白菜GID1家族蛋白進行多重序列比對分析發(fā)現，它們的氨基酸序列一致性為73.67%，但均具有保守的激素敏感性脂肪酶活性的HGG和GXSXG結構域（圖3）。Hirano等[11]研究表明，擬南芥GID1蛋白與GA或DELLA的蛋白結合區(qū)有13個結合功能域，從N端到C端依次是TWVLIS、LDR、FFHGGSF、HS、IYD、YRR、DGW、GDSSGGNI、GNI、MF、LDGKYF、WYW和GFY。而對大白菜BrGID1蛋白分析發(fā)現，BrGID1b3蛋白TWVLIS結構域中的L被F取代，BrGID1a蛋白GNI結構域中的I被V取代，其它區(qū)域則都是保守的。以上結果表明，大白菜BrGID1蛋白在GA信號轉導中發(fā)揮重要功能的氨基酸殘基與模式植物一樣都是保守的，它們在GA作用機制中的受體功能可能是完整的。

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